Name: investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation
Uploaded: 2017-08-14T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation at JoVE.com

Alison Michels är mottagare av en Frederick Banting och Charles Best Kanada Graduate stipendium från den kanadensiska institut för hälsa forskning (CIHR). Laura L. Swystun är mottagaren en CIHR gemenskap. David Lillicrap är mottagare av en Kanada forskning stol i molekylär hemostas. Denna studie finansierades delvis av en CIHR löpande grant (MOP-97849).

Dessa studier har godkänts av forskning etik styrelsen av Queen's University, Kanada.
1. endotelceller stimulering
<ol><li>
Kollagen-coat en 6-väl vävnadsodling tallrik.
	<ol>
<li>24 timmar i förväg, coat en 6-väl vävnadsodling tallrik vid 37 ° C med 1 mL av kollagen buffert (50 µg/mL rat tail kollagen typ 1 med 0,02 M isättika).</li>
		<li>Tvätta brunnarna två gånger med 2 mL av Hank's Balanced Salt lösning (HBSS). Obs: Plattor kan vara insvept i aluminiumf...

Medan den fysiologiska betydelsen av VWF-trombocyter strängar förblir kontroversiell på grund av deras snabb upplösning i närvaro av den VWF-klyva proteasen ADAMTS13, tjänar de som kvantifierbara in vitro- modell av trombocyter rekrytering av VWF till en webbplats på som en tromb kan bilda i närvaro av lokaliserade ökar i Histon nivåer5. Dessutom i patologier saknar ADAMTS13 aktivitet-sådan som trombotisk trombocytopen purpura (TTP) - eller i inflammatoriska mikromiljö - där ...

Trombos är en ledande orsak till dödlighet i världen1 och kan utvecklas i svar todysregulated trombocyter aktivering och trombin generation i båda veinsand artärer. Plasmanivåerna av VWF är en nyckelroll i regulering av koagulation, whereby låga nivåer (< 50%) resultera i en blödningssjukdom som kallas von Willebrands sjukdom (VWD)2 och höga nivåer (> 150%) är associerade med en ökad risk för venös3 och arteriell4 trombos.
VWF är ett multimeric glykoprotein syntetiseras av megakaryocyter och endotelceller och lagras i trombocytantal α-granulat och WPBs, respektive. Vid hemostatiska utmaning, kan VWF frigöras från endotelceller WPBs att tjudra cirkulerande trombocyter till aktiverade endotelceller5 eller exponerade kollagen på fartyget vägg6. Förankring av VWF att endotelceller har visat sig vara medierade av P-selektin7 och integrin αvβ38. Den påföljande frisättningen av trombocyter α-granule butiker kan ytterligare öka lokaliserade VWF koncentrationer för att stabilisera trombocyt-trombocyter interaktioner för trombocyter plug bildandet, ställningen behövs för förökning av koagulationskaskaden och fibrin nedfall. VWF trombocyter-bindande verksamhet regleras av dess multimeric struktur, med hög-molekylär vikt multimers besitter större hemostatiska aktivitet9,10. I omlopp fungerar VWF också som bärare för den koagulationsfaktor VIII.
Vätska skjuvspänningen är en viktig regulator av VWF fysiologi. I avsaknad av skjuvspänning finns VWF i klotformiga form, dölja bindande domäner för trombocyter glykoprotein Ib vidhäftning11. När skjuvspänning är närvarande, är klyvning platsen för en metalloprotease, en disintegrin och metalloprotease med thrombospondin motiv (ADAMTS13), exponerad. ADAMTS13 klyver naken och trombocyt-inredda VWF strängar för att reglera multimer storlek, vilket minskar dess hemostatiska aktivitet12.
VWF är ett akut-fas protein, och många stimuli, inklusive hypoxi13, infektion14och proinflammatoriska cytokiner, har visat att medla VWF release från endotelceller. Liknar andra inflammatoriska agenter, extracellulär histoner har också visats inducera systemisk VWF release i möss15,16 och aktiveringen av trombocyter in vitro-17,18, 19. Detta visade sig vara beroende av Histon subtyp, som skillnader i lysin och arginin innehåll kan påverka funktion15. Vår studie syftar till att upprätta en flöde kammare modell för att undersöka påverkan av lysin-rika (HK) och arginin-rika (HR) Histon subtyper och secretagogues på endotelceller VWF release och realtid trombocytantal fånga, potentiella tidiga händelser i inflammation-inducerad trombos.
Detta flöde kammare metodik recapitulates i vivo interaktioner mellan subendothelial kollagen, endotelceller, VWF och trombocyter i ett in vitro- system som är visuell, reproducerbar och kvantifierbara. Det möjliggör realtid bedömning av alla aspekter av den väg som reglerar VWF-blodplättar interaktion, inklusive WPB sekretion, trombocytaktivering och VWF proteolys. Studier av VWF under kontrollerade skjuvspänning har använts för att utvärdera VWD mutationer som försämrar VWF release och trombocyt-bindande funktion20, WPB fysiologi21och VWF klyvning av ADAMTS135. Vi använder denna metod för att kvantifiera VWF-trombocyter sträng bildas till följd av ett inflammatoriskt stimulus: extracellulära histoner.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calf-thymus unfractionated histones (UH)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>HLY</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus lysine-rich histones (HK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5505</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus arginine-rich histones (HR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4830</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Reconstituted in DMSO (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7125-1G</td>
			<td>Reconstituted in water (50 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39; Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D273</td>
			<td>Reconstituted in methanol (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Coating Antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0026</td>
			<td>For VWF ELISA and histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>For histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Reference Plasma</td>
			<td>Precision BioLogic</td>
			<td>CCNRP-05</td>
			<td>For VWF ELISA standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8287</td>
			<td>Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>For culturing and initial seeding of BOEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail Collagen Type 1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>For endothelial cell stimulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide III 0.1 (flow chambers)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td>This product has been discontinued. We suggest using &#181;-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunted 18G Needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation

Von Willebrand-faktor (VWF) är en multimeric glykoprotein koagulationsfaktor som förmedlar trombocytantal adhesion och aggregering på platser av endoteliala skador och som bär faktor VIII i cirkulationen. VWF är syntetiseras av endotelceller och släpps antingen konstitutivt i plasma eller lagras i specialiserade organeller, kallas Weibel-Palade organ (WPBs), på begäran släpps i svar hemostatiska utmaningen. Prokoagulanta och proinflammatoriska stimuli kan snabbt framkalla WPB exocytos och VWF release. Majoriteten av VWF släpptes av endotelceller cirkulerar i plasma; dock är en del av VWF förankrad till endotelceller ytan. Under förhållanden av fysiologiska skjuvning, kan endotel-förankrade VWF binda till trombocyter, bildar en VWF-trombocyt-sträng som kan representera nidus tromb bildas. Ett flöde kammaresystem kan användas för att visuellt följa frisläppandet av VWF från endotelceller och det efterföljande trombocytantalet fånga på ett sätt som är reproducerbara och relevant för patofysiologin av VWF-medierad tromb bildas. Användningen av denna metod, endotelceller är odlade i en kammare som flödet och därefter stimuleras med secretagogues att framkalla WPB exocytos. Tvättade trombocyter är sedan perfusion över aktiverade endotelet. Trombocyter aktiveras och därefter binda till avlånga VWF strängar i riktning mot vätskeflöde. Med hjälp av extracellulära histoner som prokoagulanta och proinflammatoriska stimulans, observerat vi ökad VWF-trombocyter sträng bildning på Histon-behandlade endotelceller jämfört med obehandlade endotelceller. Det här protokollet beskriver en kvantitativ, visuell och realtid bedömning av aktiveringen av VWF-trombocyter interaktioner i modeller för trombos och hemostas.

Att direkt bedöma effekten av histoner på VWF release från endotelceller, utsätts vi konfluenta BOECs till serumfritt medium innehållande PMA (positiv kontroll), UH, HR och HK för 2 h. Vi visade att HK inducerade en 2-faldig ökning av VWF protein (VWF:Ag) i medlet av behandlade endotelceller (figur 1). Intressant, när BOECs stimuleras med UH och HR, upptäcktes det mindre VWF:Ag på medellång än i obehandlat skick. Vi hade en hypotes att eftersom Hi...

Watch this Scientific Journal Video about Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation at JoVE.com

Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

I detta papper, vi beskriver en metod för att bedöma endothelial von Willebrands faktor release och det efterföljande trombocytantalet fånga under vätska skjuvspänningen svar på inflammatoriska stimuli med en in vitro- flöde kammaresystem.

Utreda von Willebrand faktor patofysiologi använder en modell för flödet av avdelningen av von Willebrands faktor-trombocyter sträng bildandet

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Funktionell bedömning av intestinal motilitet och tarmväggen Inflammation i Gnagare: Analyser i en standardiserad modell av intestinal manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Orthotopic tunntarmstransplantation i råttor

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

The Rabbit Blood-shunt Model for the Study of Acute and Late Sequelae of Subarachnoid Hemorrhage: Technical Aspects

Kaninen Blod-shunt modell för studier av akut och sen Sena effekter av subaraknoidalblödning: Tekniska aspekter

Early brain injury and delayed cerebral vasospasm both contribute to unfavorable outcomes after subarachnoid hemorrhage (SAH). Reproducible and ...

Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Musmodell av alloimmuna vaskulär Avslag och transplantations åderförkalkning

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Strategisk Endothelial Cell Tube Formation analys: Jämföra Extracellulär Matrix och tillväxtfaktor Minskad Extracellulär Matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Micro-dissektion av emalj Organ från Mandibular framtand hos råttor exponerade för miljögifter

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

Isometrisk kontraktilitet mätning av mus mesenterica artär med Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Vagus Nerve Stimulation As an Adjunctive Neurostimulation Tool in Treatment-resistant Depression

Vagus nervstimulering som ett understödjande neurostimulering verktyg för behandlingsresistent Depression

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression ...

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

En In Vitro Hemodynamic Loop Modell för att undersöka hemocytokompatibilitet och värdcell aktivering av Vaskulär medicintekniska produkter

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive ...

Surfactant Depletion Combined with Injurious Ventilation Results in a Reproducible Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Surfactant Depletion Combined with Injurious Ventilation Results in a Reproducible Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

Utarmning av tensid i kombination med skadlig ventilation resulterar i en reproducerbar modell av akut respiratoriskt nödsyndrom (ARDS)

Various animal models exist to study the complex pathomechanisms of the acute respiratory distress syndrome (ARDS). These models include pulmo-arterial ...