Name: isolation of human myoblasts, assessment of myogenic differentiation, and store-operated calcium entry measurement
Uploaded: 2017-07-26T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement at JoVE.com

وقد حظي هذا العمل بدعم من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (المنحة رقم 310030-166313)، والمؤسسة السويسرية للبحث العلمي، و &quot;مؤسسة مارسيل ليفايلانت&quot;، و &quot;مؤسسة البحث العلمي&quot;.

تم جمع عينات العضلات البشرية (الأنسجة التي تم الحصول عليها من عضلات نصف نصية) خلال جراحة العظام على المرضى الأصحاء كنفايات جراحية. وقد أجريت جميع الأساليب المتعلقة بالدراسة البشرية وفقا للمبادئ التوجيهية والأنظمة الصادرة عن السلطات الصحية التنظيمية السويسرية وواف?...

<ol>
	<li>Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+Cells+and+Skeletal+Muscle+Regeneration.">Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration.</a> Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).</li><li>Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+skeletal+muscle+stem+cells.">Adult skeletal muscle stem cells.</a> Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).</li><li>Chen, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+blood-vessel-derived+multipotent+precursors+from+human+skeletal+muscle.">Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (90), e51195 (2014).</li><li>Zheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+myogenic+stem+cells+from+cultures+of+cryopreserved+human+skeletal+muscle.">Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle.</a> Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).</li><li>Charville, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+Vivo+Expansion+and+In+Vivo+Self-Renewal+of+Human+Muscle+Stem+Cells.">Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells.</a> Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).</li><li>Stiber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM1+signalling+controls+store-operated+calcium+entry+required+for+development+and+contractile+function+in+skeletal+muscle.">STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle.</a> Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).</li><li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-Operated+Calcium+Channels.">Store-Operated Calcium Channels.</a> Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).</li><li>Darbellay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM1-+and+Orai1-dependent+store-operated+calcium+entry+regulates+human+myoblast+differentiation.">STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation.</a> J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).</li><li>Darbellay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+muscle+economy+myoblast+differentiation+and+excitation-contraction+coupling+use+the+same+molecular+partners,+STIM1+and+STIM2.">Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2.</a> J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).</li><li>Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+receptor+potential+cation+channels+in+disease.">Transient receptor potential cation channels in disease.</a> Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).</li><li>Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+TRPC+in+the+abnormal+calcium+influx+observed+in+dystrophic+(mdx)+mouse+skeletal+muscle+fibers.">Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers.</a> J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).</li><li>Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=During+post-natal+human+myogenesis,+normal+myotube+size+requires+TRPC1-+and+TRPC4-mediated+Ca(2)(+)+entry.">During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry.</a> J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).</li><li>Brinkmeier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRP+channels+in+skeletal+muscle:+gene+expression,+function+and+implications+for+disease.">TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease.</a> Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).</li><li>Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Store-operated+Ca2++entry+in+muscle+physiology+and+diseases.">Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases.</a> BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).</li><li>Lacruz, R. S., Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diseases+caused+by+mutations+in+ORAI1+and+STIM1.">Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1.</a> Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).</li><li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM1-Ca(2+)+signaling+is+required+for+the+hypertrophic+growth+of+skeletal+muscle+in+mice.">STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice.</a> Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).</li><li>Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orai1-dependent+calcium+entry+promotes+skeletal+muscle+growth+and+limits+fatigue.">Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue.</a> Nat Commun. 4, 2805 (2013).</li><li>Konig, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+hyperpolarization+triggers+myogenin+and+myocyte+enhancer+factor-2+expression+during+human+myoblast+differentiation.">Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation.</a> J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).</li><li>Crisan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perivascular+origin+for+mesenchymal+stem+cells+in+multiple+human+organs.">A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs.</a> Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).</li><li>Bigot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Associated+Methylation+Suppresses+SPRY1,+Leading+to+a+Failure+of+Re-quiescence+and+Loss+of+the+Reserve+Stem+Cell+Pool+in+Elderly+Muscle.">Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle.</a> Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).</li><li>Bettadapur, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+Culture+of+Aligned+Skeletal+Myotubes+on+Micromolded+Gelatin+Hydrogels.">Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels.</a> Sci Rep. 6, 28855 (2016).</li><li>Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM1L+is+a+new+actin-binding+splice+variant+involved+in+fast+repetitive+Ca2++release.">STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release.</a> J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).</li><li>Sauc, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM1L+traps+and+gates+Orai1+channels+without+remodeling+the+cortical+ER.">STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER.</a> J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).</li><li>Demaurex, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+measurements+in+organelles+with+Ca2+-sensitive+fluorescent+proteins.">Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins.</a> Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).</li></ol>

العزلة والثقافة ميوبلاستس الإنسان من العضلات والهيكل العظمي الكبار يقدم نموذج في المختبر لدراسة التمايز العضلات وتجديد العضلات. في هذه الورقة، ونحن نقدم بروتوكول يسمح لتنقية غلة عالية من ميوبلاستس الإنسان بطريقة بسيطة ومحدودة التكلفة. وبالإ...

وتتكون عضلات الهيكل العظمي البشري من مجموعات من الألياف العضلية مقلص، متعددة النوى الناجمة عن انصهار الخلايا السلائف عضلي المنشأ. العضلات الهيكلية لديها القدرة على تجديد بعد الاصابة وذلك بفضل وجود سس، الخلايا الجذعية العضلات والهيكل العظمي تقع بين غشاء البلازما ميوفيبرز (ساركولما) والصفيحة القاعدية. في العضلات غير المصابة، سس موجودة في الغالب في حالة هادئة. ردا على الإجهاد الميكانيكي أو الإصابة، سس تصبح تفعيلها (ميوبلاستس)، تتكاثر، وتخضع إما التمايز لتشكيل ميوفيبرز جديدة أو التجديد الذاتي لتجديد تجمع سك 1 ، 2 . على مر السنين، تم تطوير العديد من التقنيات لعزل سس وذريتها، ميوبلاستس، من خزعات العضلات والهيكل العظمي. مع فهم أكبر من علامات سطح الخلية أعرب عن هذه الخلايا ومنهجية الفلورسنت تنشيط خلية الفرز (فاكس) 3، 4 ، 5 ، فمن الممكن الآن لعزل السكان النقي من ميوبلاستس الإنسان من عينات العضلات. إشارات الكالسيوم ينظم تطوير العضلات والهيكل العظمي، والتوازن، والتجديد. على وجه الخصوص، كا 2 + دخول التي يتم تنشيطها بعد استنزاف مخزن داخل الخلايا، ودعا سوس، له أهمية كبيرة 6 لهذه العمليات. على التحفيز الخلية، وانخفاض مستوى كا 2 + في الشبكة إندو / ساركوبلازميك (إير / سر)، والذي بدوره ينشط غشاء البلازما كا 2 + القنوات التي تسمح كا 2 + دخول لإعادة ملء إير / سر 7 . البروتينات الرئيسية اثنين المشاركة في سوس هي إير / سر كا 2 + -Sensing التفاعل اللحمية جزيء 1 (STIM1) البروتين وغشاء البلازما كا 2+ قناة Orai1. العضلات والهيكل العظمي يعبر عن هذه البروتينات اثنين، فضلا عن البروتينات الأخرى من نفس الأسر (STIM2 أند Orai2-Orai3) 8 ، 9 والعديد من كا 2+ قنوات -permeable من مستقبلات عابرة كانونيكال (تريك) الأسرة 10 ، 11 ، 12 ، 13 . كا 2 + دخول من خلال مسار سوس هو من أهمية كبيرة لتشكيل العضلات / تجديد 14 . الطفرات من STIM1 أو أوراي 1 البروتينات لها آثار ضارة على وظيفة العضلات، مما يؤدي أساسا إلى نقص التوتر العضلي 15 . نماذج حيوانية مع ضعف سوس كما عرض انخفاض كتلة العضلات والقوة، جنبا إلى جنب مع تعزيز فتيغابيليتي 6 ، 16 ، 17 . كما ذكر، يتم التعبير عن ستيم أخرى والبروتينات أوراي، فضلا عن العديد من القنوات تريك، في العضلات والهيكل العظمي، ولم يتم تحديد أدوار كل منها حتى الآن. بواسطة يطرق دتملك مستوى التعبير، وبالتالي فمن الممكن للتحقيق في آثارها في سوس وأدوارها خلال التمايز العضلات الهيكل العظمي البشري. ويمكن إجراء قياس سوس باستخدام نهجين مختلفين: التسجيلات الكهربية الحالية والقياسات كا 2 + . الفيزيولوجيا الكهربية هو بالتأكيد طريقة أكثر مباشرة، كما أنه يقيس التيار من الفائدة والتوقيع الكهربية المرتبطة بها. ومع ذلك، هذه التقنية من الصعب جدا أن تنطبق على خلايا العضلات، وذلك أساسا بسبب حجم كبير من خلايا العضلات وصغر حجم التيار سوس الذاتية. سايتوسوليك كا 2 + التصوير هو من الناحية الفنية يمكن الوصول إليها جدا، ولكن التدبير هو أكثر مباشرة، كما كا 2 + مستوى يقاس في السيتوسول يعكس كلا من دخول كا 2 + وإعادة ضخ للخروج من الخلية أو في المخازن الداخلية. منهجية تشمل عزل ميوبلاستس من قطع صغيرة من سكيل الإنسانإتال العضلات بعد الهضم الأنزيمي، التضخيم، و فاكس هو موضح في هذه الورقة. يتم وصف عملية تمايز العضلات والبروتوكول المناعي لمتابعة التعبير عن علامات التمايز مع مرور الوقت 18 . وأخيرا، يتم شرح قياس سوس ودور القنوات الأيونية المختلفة في كا 2 + الإشارات والتمايز العضلات والهيكل العظمي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="944">
	<tbody>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Ham&#8217;s F10</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">31550-023</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">FCS</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">10270-106</td>
			<td style="width:201px;">Lot 41G5532K</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">BSA</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">O5482</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">fetuin</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">F3385</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">EGF</td>
			<td style="width:235px;">Corning</td>
			<td style="width:187px;">354001</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Dexamethansone</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">D1756</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Insulin</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">I9278</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Creatine</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">27900</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Pyruvate</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">P4562</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Uridine</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">U3003</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Gentamycin</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">15710-049</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Trypsin-EDTA 0.05%</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">25300-062</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">70 &#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:235px;">Falcon</td>
			<td style="width:187px;">352350</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">40 &#956;m cell strainer</td>
			<td style="width:235px;">Falcon</td>
			<td style="width:187px;">352340</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Falcon 50&#160;ml tube</td>
			<td style="width:235px;">Falcon</td>
			<td style="width:187px;">352070</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Falcon 15&#160;ml tube</td>
			<td style="width:235px;">Falcon</td>
			<td style="width:187px;">352096</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Falcon 5&#160;ml tube (FACS)</td>
			<td style="width:235px;">Falcon</td>
			<td style="width:187px;">352058</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Culture medium: OPTI-MEM</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">31985-047</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Transfectant reagnt: RNAiMax</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">1756064</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">PBS</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">14190-094</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Mounting medium</td>
			<td style="width:235px;">Fluka</td>
			<td style="width:187px;">10981</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Mouse anti-MyHC *</td>
			<td style="width:235px;">DSHB</td>
			<td style="width:187px;">MF20&#160;</td>
			<td style="width:201px;">concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Mouse anti-myogenin</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmigen</td>
			<td style="width:187px;">556358</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Rabbit anti-MEF2</td>
			<td style="width:235px;">Santa Cruz Biotech</td>
			<td style="width:187px;">C-21</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Goat anti-mouse Alexa488</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">A11029</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Goat anti-rabbit Alexa 546</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">A11035</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Mouse anti human CD56-Alexa488</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">557699</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Mouse anti human CD146-PECy7</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">562135</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Mouse anti human CD45-PE-CF594</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">562279</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Mouse anti human CD34-APC</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">345804</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Mouse anti human CD144-PE</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">560410</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Alexa Fluor 488 mouse IgG1k</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">557702</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">PECy7 mouse IgG1k</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">557872</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">PE-CF594 mouse IgG1k</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">562292</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">APC mouse IgG1k</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">550854</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">PE mouse IgG1k</td>
			<td style="width:235px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:187px;">556650</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:321px;">DAPI</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">D9542</td>
			<td style="width:201px;">CAUTION:&#160; toxic compound</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:235px;">Fluka</td>
			<td style="width:187px;">762400</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Fura-2 AM</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">F1201</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:321px;">Pluronic F-127</td>
			<td style="width:235px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">P3000MP</td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:321px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:235px;">Sigma</td>
			<td style="width:187px;">T9033</td>
			<td style="width:201px;">CAUTION&#160;: toxic compound&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:321px;">Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3</td>
			<td style="width:235px;">Molecular Device</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td style="width:201px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td colspan="2" height="24" style="height:24px;">*&#160;: MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A.&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human myoblasts, assessment of myogenic differentiation, and store-operated calcium entry measurement

الخلايا الأقمار الصناعية (سك) هي الخلايا الجذعية العضلية الواقعة بين غشاء البلازما من ألياف العضلات والصفيحة القاعدية المحيطة بها. وهي ضرورية لتجديد العضلات. عند الإصابة، والذي يحدث في كثير من الأحيان في العضلات والهيكل العظمي، يتم تنشيط سس. أنها تتكاثر كما ميوبلاستس والتفريق لإصلاح آفات العضلات. من بين العديد من الأحداث التي تحدث خلال تمايز العضلات، كا 2 عصاري خلوي إشارات ذات أهمية كبيرة. هذه الإشارات كا 2 + تنشأ من كا 2 + الإفراج عن كا 2 + مخازن الداخلية، وكذلك من كا 2 + دخول من الفضاء خارج الخلية، ولا سيما إدخال كا 2+ التي تديرها مخزن (سوس). تصف هذه الورقة المنهجية المستخدمة للحصول على السكان النقي من ميوبلاستس الإنسان من عينات العضلات التي تم جمعها بعد جراحة العظام. يتم هضم الأنسجة ميكانيكيا و إنزيميا، ويتم تضخيم الخلايا ومن ثم فرزها عن طريق التدفق الخلوي وفقا لوجود سبيسيعلامات غشاء فيك. بمجرد الحصول عليها، يتم توسيع ميوبلاستس الإنسان وملتزمة للتمييز عن طريق إزالة عوامل النمو من وسط الثقافة. يتم استخدام مستويات التعبير من عوامل النسخ المحددة والمناعية في المختبر لتقييم عملية التمايز العضلي في ظروف السيطرة وبعد إسكات البروتينات المشاركة في كا 2 + الإشارات. وأخيرا، ونحن بالتفصيل استخدام فورا-2 باعتباره كا 2 راتيوميتريك مسبار التي توفر قياسات موثوقة وقابلة للتكرار من سوس.

بعد التفكك الأنزيمي لعينة العضلات البشرية، تم تضخيم الخلايا في جنرال موتورز. تم الحصول على ميوبلاستس الإنسان، والمعروفة باسم CD56 + / CD146 + / CD45- / CD34- / CD144- الخلايا، بعد فاكس. ميوبلاستس تمثل أكثر من 60٪ من السكان تحليلها ( الشكل 1 ). تم إعادة تكوين ميوبلاستس ال?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement at JoVE.com

Isolation of Human Myoblasts, Assessment of Myogenic Differentiation, and Store-operated Calcium Entry Measurement

هنا، نحن تصف منهجية للحصول على السكان النقي من ميوبلاستس الإنسان من الأنسجة العضلية الكبار. وتستخدم هذه الخلايا لدراسة في المختبر التمايز العضلات والهيكل العظمي، وعلى وجه الخصوص، لدراسة البروتينات المشاركة في كا 2 + الإشارات.

عزل ميوبلاستس الإنسان، تقييم التمايز العضلي، وقياس دخول الكالسيوم التي تديرها المخازن

Satellite cells (SC) are muscle stem cells located between the plasma membrane of muscle fibers and the surrounding basal lamina. They are essential for ...

The overall goal of this procedure is to obtain a pure population of human myoblasts from adult skeletal muscle. These cells are used for functional studies such as assessment of myogenic differentiation and measurement of store-operated calcium entry. The main advantage of this technique is that it allows a rapid, simple and reproducible isolation of human primary myoblasts.These myoblasts are the new ex-vivo to study the calcium signaling during muscle regeneration. This method can help answer key questions in the muscle field such as, identifying the ionic channels and the transcription factors involved during muscle differentiation. For this method can provide insight into gene functions during human myogenic differentiation.It can also be applied to other studies such as, potential for using myogenic stem cells to treat muscular dystrophies. Transfer the muscle sample into a sterile six centimeter plate, wash the sample with PBS twice. Remove any remaining adipose tissue and weigh the sample.Next, add trypsin and mince the muscle into pieces smaller than two millimeters in size. Once minced, use a 10 milliliter pipette to transfer the tissue into a 200 milliliter dissociation bottle containing a stir bar, then continue collecting minced tissue in trypsin solution until the dissociation bottle is filled to 90 milliliters. Now, incubate the tissue in a water bath at 37 degrees celsius for 60 minutes with gentle stirring.After an hour, add 10 milliliters of FCS to stop the reaction and homogenize the mixture using trituration. Now, load 70 micron strainers onto two 50 milliliter tubes and pass half of the cell suspension through each strainer by pipetting the suspension into the filters. Next, make a suspension of the cells in growth medium and plate 200, 000 cells onto six centimeter plates with four milliliters of medium.Incubate the plates, changing the medium every third day. After five to seven days, the cells should be 70%to 80%confluent, then, stain them. To begin, rinse the plate of confluent cells with PBS.Then, add one milliliter of trypsin solution and let the enzyme work for three minutes. Stop the reaction by adding two milliliters of medium and collect the cells in a 15 milliliter tube. Then, spin the cells down and re-suspend them in one milliliter of medium.Next, take a cell count while storing the cells on ice. For the facts analysis, load seven tubes with 100, 000 cells each. Load the remaining cells into an eighth tube for sorting.Wash the cells with one milliliter of cold fax buffer, then, centrifuge the tubes and aspirate and discard the supernatant. Add back 200 microliters of fax buffer with the appropriate antibodies and let the cells incubate on ice for 30 minutes. After 30 minutes, wash the cells again and re-suspend them in 500 microliters of fax buffer, then sort the cells using a flow cytometer.After excluding the CD45 positive hematopoietic cells, separate the CD45 negative cells based on CD56 expression. Then, gate the CD56 positive population for CD34, CD144 and CD146. Re-analyse a fraction of the sorted population, to check the purity.Now, pull the human myoblasts and wash them with five milliliters of medium. Then re-suspend them in one milliliter of medium. Transfer the suspension to a six centimeter plate with four milliliters of medium and incubate the plate at 37 degrees celsius with 7%carbon dioxide.For this procedure, have cultured myoblasts and make fresh transvection medium. Incubate the medium at room temperature for 15 to 20 minutes. During the medium incubation, prepare the myoblasts.First, rinse them once with PBS. Then, trypsinise the adherent cells. Stop the reaction by adding two milliliters of medium.Then, collection the cells into a 50 milliliter tube. Spin them down and re-suspend them in one milliliter of medium. For each transvection, prepare 500, 000 cells in 200 microliters of medium.To each 500 microliters of transvection medium, add a 200 microliter aliquot of cells and then mix using only two strokes of the pipette gun. Then, let the reactions proceed for five minutes at room temperature. After five minutes, transfer the reactions to 3.5 centimeter culture dishes, each containing one glass cover slip.Next, add 1.3 milliliters of medium for a final volume of two milliliters and incubate the dishes. After 48 hours of differentiation, the cells can be immunostained or analyzed using calcium imaging. For either option, first carefully wash the cells twice using one milliliter of room temperature PBS to wash.Try to avoid detaching the myotubes. For a calcium imaging, cover the washed cells with two micromolar fura-2 AM plus one micromolar threonic acid in calcium containing medium. Then, let them incubate for about 30 minutes before mixing.Next, wash the cells twice with unmodified calcium containing medium and then, incubate them for 10 to 15 minutes for the esterification. Now, remove the cover slip from a culture plate and install it into the experimental chamber. Load the chamber with calcium containing medium, place it under a microscope, then, start the data recording.Fura-2 is excited alternately at 340 and 380 nanometers. The emission light is collected at 510 nanometers. Diving the 340 nanometer nanometer images by the 380 images, provides the image ratios as the fluctuations and calcium concentration are relatively low, acquire one image ratio every two seconds.After two or three minutes, replace the medium with calcium free medium. Then, for one or two minutes, monitor the activity of the store operated calcium in the cells. Next, add one micromolar thapsigargin to the cells to deplete their internal calcium stores.Wait eight to 10 minutes, then, rapidly replace the medium with the calcium containing medium and record for five minutes while calcium enters the cells via the suc e channels. After terminating the experiment, analyze the images. Select an area where there are no cells for region one, which defines the background, then, select an area in the cytoplasm for region two.The two regions can be drawn on any of the images in the series. Next, go to the run experiments tab and select reference images for the 340 and 380 channels, select region one, then click on subtract background. Now, run the entire experiment to remove the background from all the images.Once completed, click log data option to open a spreadsheet in which the time and the ratio data are logged. Muscle cells were grown up, expanded and sorted using fax. Myoblasts represented more than 60%of the analyzed population.The primary human myoblasts were then cultured in differentiation medium and immunostained for the transcription factor of MEF2 and myosin heavy chain proteins. A majority of cells expressed myosin heavy chain and formed myotubes with fusion index values of about 60%the other 40%of the cells remained undifferentiated mononucleated cells, also known as reserve cells. The described store operated calcium entry experiment were successfully performed on the differentiated cells.Performing the same experiment to on cells transvected with small interfering RNA, directed against calcium permeable channels of the TRPC family, shows that the knockdown had a measurable impact on store operated calcium entry. After watching this video, you should have a good understanding of how to isolate human myoblasts from adult skeletal muscle. We use these cells to study the successive steps of muscle differentiation and in particular, deactivation of the transcription factors and calcium channels.Once mastered, this technique can be done in less than three hours if it is performed properly. It is a rapid, simple, reproducible method that obtains the yield of human myoblasts. While attempting this procedure, it is important to prevent the myoblast cultures from reaching full confidence, as there will be unwanted spontaneous differentiation.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

العزلة والكمية Immunocytochemical توصيف الخلايا عضلي الابتدائية والخلايا الليفية من العضلات الهيكلية البشرية

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

تحليل الزرد اليرقات الهيكل العظمي النزاهة العضلات مع ايفانز الأزرق صبغ

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Differentiation of the SH-SY5Y Human Neuroblastoma Cell Line

التفريق بين الخط خلية SH-SY5Y العصبية الإنسان

Having appropriate in vivo and in vitro systems that provide translational models for human disease is an integral aspect of research in neurobiology and ...

Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues

العزلة وتمايز الخلايا الجذعية الدهنية المشتقة من الخنزير تحت الجلد الدهنية الأنسجة

Obesity is an unconstrained worldwide epidemic. Unraveling molecular controls in adipose tissue development holds promise to treat obesity or diabetes. ...

Preparation and Culture of Myogenic Precursor Cells/Primary Myoblasts from Skeletal Muscle of Adult and Aged Humans

إعداد والثقافة من الخلايا عضلي السلائف / Myoblasts الابتدائية من العضلات الهيكلية من الكبار والمسنين البشر

Skeletal muscle homeostasis depends on muscle growth (hypertrophy), atrophy and regeneration. During ageing and in several diseases, muscle wasting ...

Directed Differentiation of Primitive and Definitive Hematopoietic Progenitors from Human Pluripotent Stem Cells

وجه التفريق بين فروعه المكونة للدم البدائي والنهائي من الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية

One of the major goals for regenerative medicine is the generation and maintenance of hematopoietic stem cells (HSCs) derived from human pluripotent stem ...

Isolation, Culture, and Differentiation of Bone Marrow Stromal Cells and Osteoclast Progenitors from Mice

العزلة، والثقافة، وتمايز الخلايا اللحمية في النخاع العظمى وفروعه اوستيوكلاست من الفئران

Bone marrow stromal cells (BMSCs) constitute a cell population routinely used as a representation of mesenchymal stem cells in vitro. They reside within ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

التمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية متعددة القوى في خلايا الكبد

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells

عزل وإكثار بريون البروتين التعبير خلال تمايز الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية البشرية لب الأسنان

Bioethical issues related to the manipulation of embryonic stem cells have hindered advances in the field of medical research. For this reason, it is very ...