Name: assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells
Uploaded: 2017-10-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

تم إجراء هذا البحث كجزء من المشروع تحت عنوان 'التنمية والتصنيع للمواد الخام مستحضرات التجميل ذات القيمة العالية من الطحالب البحرية'، وتموله وزارة للمحيطات ومصائد الأسماك، وكوريا، وأيده على منحة داخلية (2Z04930) من KIST معهد دانوي للمنتجات الطبيعية.

1-"إعداد الكواشف" <ol><li>إضافة 10 ميليلتر (1 مم) فينيلميثيلسولفونيل الفلوريد الحل، 10 ميليلتر (س 1 من الأسهم x 100) الحل كوكتيل مثبط البروتياز، و 10 ميليلتر (س 1 من الأسهم x 100) من الفوسفاتيز حل كوكتيل مثبط لمل 1 x radioimmunoprecipitation 1 المقايسة (ريبا) العازلة لإعداد المخزن المؤقت تحلل ريبا كاملة-</li>
	<li>تحضي...

هذه المخطوطة شروط إجرائية مختلفة للكشف عن مجموع تاو وفوسفوريلاتيد تاو في خلايا سرطان القولون والمستقيم تعامل مع الكركمين وليكل. لتقييم حالة الفسفرة عموما تاو في عينات البروتين، وصفت مقايسة الفوسفاتيز. يمكن استخدام هذا الفحص يحتمل أن تكون دراسة حالة الفسفرة أي البروتين.
هذ...

واعتبرت تاو أصلاً البروتينات المرتبطة microtubule الحرارة مستقرة كان المنقي يشترك مع توبولين1. وأعرب تاو هو حصرا في أعلى حقيقيات النوى2،،من34. وتتمثل المهمة الرئيسية تاو هو السيطرة microtubule الجمعية1،،من56. كما أنه يسهم البلمرة microtubules7، النقل محواري8، والتغييرات في القطر محواري9، تشكيل قطبية عصبي، ونيوروديجينيريشن10. تاو أيضا بمثابة سقالة بروتين للتحكم في بعض مسارات الإشارات. تشير دراسات الدماغ الفئران إلى أن تاو العصبية وأنه يموضع أساسا في محاور عصبية11. نظراً لأن تاو أساسي البلمرة microtubule وتنمية الخلايا العصبية، تاو كان الافتراض بأن تلعب دوراً رئيسيا في التنمية محواري في الجهاز العصبي المركزي؛ كانت هذه الفرضية في وقت لاحق يتم التحقق من تجارب في المختبر و في فيفو . بالإضافة إلى الخلايا العصبية، وهو أعرب عن تاو في الخلايا غير العصبية المختلفة، بما فيها الكبد والكلى والعضلات خلايا12،13. وأعرب تاو هو أيضا في الثدي والبروستات، القولون، والمعدة، وسرطان البنكرياس خلية خطوط وأنسجة14،15،16،،من1718، 19-تاو موجود أيضا في هيئة إدراج التهاب العضل توبولوفيلامينتس الملتوية في الهيئات إدراج20.
تاو قد تحمل عدة تعديلات بوستترانسلاشونال. جميع التعديلات بوستترانسلاشونال، الفسفرة هي الأكثر شيوعاً. الفسفرة تاو زيادة إنقاص النسب ل microtubules، أخيرا المزعزعة للاستقرار في سيتوسكيليتون. وقد وصف مواقع الفسفرة خمسة وثمانون في البروتين تاو المعزولة من أنسجة المخ البشري مرض الزهايمر. وتشكل 53% من هذه المواقع، سيرين، ثريونين 41% وفقط 6% تيروزين بقايا21،،من2223. ويؤثر الفسفرة تاو التعريب والدالة وملزم، القابلية للذوبان وقابليته لتعديلات أخرى بوستترانسلاشونال. كما تاو الفسفرة إلى أكثر من المدى الطبيعي (أو مشبعة تماما مع مجموعات الفوسفات) يعرف باسم هايبرفوسفوريليشن التي يتطابق الخصائص الهيكلية والوظيفية لمرض الزهايمر24. يحافظ على الأداء السليم ل microtubules محواري تاو ويضمن أداء الخلايا العصبية طبيعية في ظل الظروف الفسيولوجية. ومع ذلك، فشل تاو هايبرفوسفوريلاتيد للحفاظ على ربط microtubule منظمة تنظيماً جيدا، مما تسبب في فقدان الخلايا العصبية بسبب تفكك microtubule. المستويات العادية من الفسفرة تاو مطلوبة من أجل تاو سليمة الأداء، لكن تاو فشل لتعمل بشكل طبيعي إذا تم تعديل مستوى الفسفرة المميزة لها، وإذا لم هايبرفوسفوريلاتيد25. في مرض الزهايمر، وبعض اضطرابات الأعصاب المرتبطة بالسن الأخرى، يصبح هايبرفوسفوريلاتيد تاو وأشكال خيوط حلزونية المزدوجة والتشابك نيوروفيبريلاري26،27. وهكذا، أساليب لتحديد الفسفرة تاو وملزمة microtubule هامان.
سرطان القولون والمستقيم، سرطان المرتبطة بالشيخوخة، الثالث الأكثر شيوعاً تشخيص السرطان والسرطان المسببة للوفاة الثالثة بارزة ل كل من الرجال والنساء28. سرطان القولون والمستقيم واحد من أنواع السرطان الرئيسية المسببة للوفاة في العالم الغربي29. نظراً لأن سرطان القولون والمستقيم ومرض الزهايمر المرتبطة بالشيخوخة، وكلاهما يحدث أساسا في البلدان المتقدمة حيث يتمتع الناس بالعادات الغذائية مماثلة، قد على نحو ما الربط بين هذين المرضين. وبالإضافة إلى ذلك، الخلايا السرطانية تاو-الإيجابية والسلبية تاو تستجيب بشكل مختلف لوكلاء العلاج الكيميائي، مثلاً، باكليتاكسيل16.
الكركمين واحد من المشتقات الرئيسية من كركم لونغا، الكركم التوابل الهندية30. لعدة قرون، السكان في جنوب آسيا قد استهلكت الكركم في وجباتهم بشكل يومي. الكركمين ويستخدم لعلاج الأمراض المختلفة، بما في ذلك سرطان القولون والمستقيم ومرض الزهايمر والسكري، التليف الكيسي، مرض التهاب الأمعاء، والتهاب المفاصل، والدهون، وتصلب الشرايين ومرض القلب الاقفاري31، 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38-الليثيوم أيضا يمكن أن تقتل خلايا سرطان القولون والمستقيم أو منع الانتشار على39. يمكن أيضا استخدام الليثيوم لعلاج مرض الزهايمر40 كما أنه يقلل من تراكم تاو ويمنع هايبرفوسفوريليشن، وكما لاحظ ماوس المعدلة وراثيا نموذج41،42،43، 44.
وتهدف هذه المخطوطة إلى: 1) قياس مجموع تاو ومستويات التعبير والرمات-تاو في الخلايا المعالجة؛ 2) تصف مقايسة الفوسفاتيز قياس الشامل تاو الفسفرة؛ 3) دراسة ملزمة microtubule من تاو؛ و 4) ترجمة تاو بالفحص المجهري [كنفوكل] في خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم، تعامل مع الكركمين أو ليكل. وتكشف النتائج أن خلية العلاج مع الكركمين، وهو عامل جيد يفترض أن العلاج الكيميائي لسرطان القولون، ويمكن أن تقلل من التعبير عن كلا تاو مجموع المعاملة مع ليكل وفوسفوريلاتيد تاو في خطوط خلايا سرطان القولون والمستقيم. يمكن أن تسبب هذه العلاجات أيضا النووية إزفاء من تاو. ومع ذلك، بشكل غير متوقع، يفشل الكركمين تحسين ربط تاو إلى microtubules.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HCT 116 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (EBSS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30024.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LS 015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Coster 3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau 13 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab19030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 708 984 001</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre Centrifuges</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td>MIKRO 200 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1912</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>78246</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubules (MT)</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MT001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C (desiccated)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LB 001-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Model 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay dye reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin (11H10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau (phospho S396) antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab109390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EF0651</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5870</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5871</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 0278</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau-352 human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 9950</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X - 100</td>
			<td>Store at around 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscopy</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells

تاو المرتبطة microtubule البروتين هو بروتين الخلايا العصبية التي يموضع معظمها في محاور عصبية. عموما تاو أمر ضروري لعمل الخلايا العصبية العادية نظراً لأنها تشارك في الجمعية ميكروتوبولي وتحقيق الاستقرار. وإلى جانب الخلايا العصبية، يتم التعبير عن تاو في الثدي والبروستاتا، المعدة، القولون والمستقيم، وسرطان البنكرياس حيث يظهر هيكل مماثل تقريبا وتمارس مهام مماثلة تاو الخلايا العصبية. مقدار تاو وعن الفسفرة يمكن تغيير وظيفتها كعامل استقرار ميكروتوبوليس، ويؤدي إلى تطوير خيوط حلزونية المزدوجة في اضطرابات الأعصاب المختلفة، مثل مرض الزهايمر. من المهم تحديد الدولة الفسفرة تاو وخصائصها microtubule ملزمة. وباﻹضافة إلى ذلك، دراسة التعريب داخل الخلايا من تاو مهم في أمراض مختلفة. هذه المخطوطة تفاصيل البروتوكولات القياسية لقياس الفسفرة تاو وملزم تاو إلى microtubules في خلايا سرطان القولون والمستقيم مع أو بدون الكركمين والعلاج ليكل. يمكن استخدام هذه العلاجات لوقف انتشار خلايا السرطان والتنمية. يتم فحص توطين تاو داخل الخلايا باستخدام إيمونوهيستوتشيميستري والفحص المجهري [كنفوكل] أثناء استخدام كميات قليلة من الأجسام المضادة. ويمكن استخدام هذه فحوصات متكررة لفحص المركبات التي تؤثر على هايبرفوسفوريليشن تاو أو ملزمة microtubule. رواية المداواة المستخدمة لمختلف تاوباثيس أو وكلاء السرطان ذات الصلة يمكن أن توصف احتمال استخدام هذه البروتوكولات.

وتم بحث التعبير عن مجموع تاو والفوسفات-تاو بعد علاج الخلايا بتركيزات مختلفة من الكركمين أو ليكل (الشكل 1). معاملة الخلايا بتركيزات مختلفة ثلاث الكركمين انخفضت مستويات التعبير تاو؛ التعبير والرمات تاو تزداد عند المعاملة بالتركيزات المنخفضة من الكركمين ول...

Watch this Scientific Journal Video about Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

والرزن الفسفرة وملزمة Microtubule جنبا إلى جنب مع تعريب بروتين تاو في خلايا سرطان القولون والمستقيم

ويصف هذه المخطوطة بروتوكولات موحدة لقياس هايبرفوسفوريليشن تاو، قياس ملزمة تاو microtubules، وتوطين تاو داخل الخلايا بعد العلاج بالعقاقير. ويمكن استخدام هذه البروتوكولات متكررة لفحص المخدرات أو غيرها من المركبات التي تستهدف الربط تاو هايبرفوسفوريليشن أو ميكروتوبولي.

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

أوليغوببتيد مسابقة الفحص لتحديد موقع الفسفرة

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

كشف الفسفرة Rab10 بالنشاط LRRK2 باستخدام مخزونات النشر الاستراتيجي-الصفحة مع علامة ربط الفوسفات

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

الكشف عن برينيليشن جتباسي صغيرة وأنشئ ملزمة باستخدام تجزئة غشاء ومقايسة الممتز GTPase مرتبطة

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

الكشف عن هيتيروديميريزيشن Isoforms البروتين باستخدام في الموقع قرب ربط التحليل

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

تحليل لطي البروتين، والنقل، وتدهور في الخلايا الحية بمطاردة نبض المشعة

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

الإنسان المحيطية عزل العدلات الدم لاستجواب باركنسون المرتبطة LRRK2 مسار كيناز من خلال تقييم Rab10 الفوسفور

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

كيانات السومو الملزمة (SUBEs) كاداات لإثراء وعزل وتحديد وتوصيف بروتين السومو في سرطان الكبد

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

اختبار محسن للسحب أحادي الجزيء لتحديد كمية فسفرة البروتين

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...