Name: assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells
Uploaded: 2017-10-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

Denne forskning blev udført som en del af projektet med titlen "Udvikling og industrialisering af høj værdi kosmetiske råvarer fra marine mikroalger", finansieret af ministeriet af oceaner og fiskeri, Korea og blev støttet af en murene tilskud (2Z04930) fra KIST Gangneung Institute of Natural Products.

1. forberedelse af reagenser <ol><li>tilføje 10 µL (1 mM) phenylmethylsulfonyl fluor opløsning, 10 µL (1 x 100 x lager) af protease hæmmer cocktail løsning og 10 µL (1 x 100 x lager) af fosfatase hæmmer cocktail løsning til 1 mL af 1 x radioimmunoprecipitation (RIPA) analysebuffer til at forberede den komplette RIPA lysisbuffer.</li>
	<li>Forbered 10 x generelle tubulin buffer (PEM) buffer.
	<ol><li>Tilføj 800 mM (6.0474 g) piperazin-N-N &#39; - bis - 2-ethanesulfonic acid, 10 mM (95.1 mg) e...

Dette manuskript etableret forskellige proceduremæssige forhold til påvisning af total tau og fosforyleret tau i kolorektal cancerceller behandles med curcumin og LiCl. For at vurdere den samlede fosforylering status af tau i protein prøver, blev en fosfatase assay beskrevet. Denne analyse kan potentielt bruges til at undersøge fosforylering status af et protein.
Denne analyse er baseret på princippet om, at fosforyleret protein bevæger sig langsommere end sin ikke-fosforyleret tilstand....

Tau blev oprindeligt identificeret som en varme-stabil mikrotubulus-forbundet protein, der blev co renset med tubulin1. Tau er udelukkende udtrykt i højere eukaryoter2,3,4. Den vigtigste funktion af tau er at kontrollere mikrotubulus forsamling1,5,6. Det bidrager også til polymerisering af mikrotubuli7, cytoskeletale transport8, ændringer i cytoskeletale diameter9, dannelsen af neuroma polaritet, og neurodegeneration10. Tau fungerer også som et protein stillads til at styre nogle signaling veje. Rotte hjerne undersøgelser tyder på, at tau er neuron-specifik, og at det primært lokaliserer i axoner11. Fordi tau er afgørende for mikrotubulus polymerisation og neuronal udvikling, var tau hypotese for at spille en større rolle i cytoskeletale udvikling i centralnervesystemet; Denne hypotese blev senere bekræftet af in vitro- og i vivo eksperimenter. Ud over neuroner, er tau udtrykt i forskellige ikke-neuronale celler, herunder lever, nyre og muskel celler12,13. Tau udtrykkes også i menneskelig brystkræft, prostata, kolorektal, gastrisk, og kræft i bugspytkirtlen celle linjer og væv14,15,16,17,18, 19. tau er også fundet i inklusion-krop myositis som snoet tubulofilaments i inklusion organer20.
Tau kan bære flere posttranslationelle modifikationer. Af alle posttranslationelle modifikationer er fosforylering den mest almindelige. Øget tau fosforylering nedsætter sin affinitet for mikrotubuli, endelig destabiliserende cytoskeleton. Firs-fem fosforylering sites er blevet beskrevet i tau protein isoleret fra menneskelige Alzheimers sygdom hjernen væv. 53% udgør i disse steder, Serin, 41% Threonin og kun 6% tyrosin restkoncentrationer21,22,23. Tau fosforylering påvirker dens lokalisering, funktion, bindende, opløselighed og dens følsomhed over for andre posttranslationelle modifikationer. Også tau fosforylering til mere end det normale omfang (eller fuldt mættet med fosfat grupper) er kendt som hyperphosphorylation, der replikerer strukturelle og funktionelle egenskaber af Alzheimers sygdom24. Tau fastholder de cytoskeletale mikrotubuli fungerer korrekt og sikrer normale neuronal velfungerende fysiologiske betingelser. Dog undlader hyperphosphorylated tau at vedligeholde en velorganiseret mikrotubulus bindende, forårsager neuronal tab på grund af mikrotubulus demontering. Normale niveauer af tau fosforylering er nødvendige for korrekt tau funktion, men tau ikke fungerer normalt, hvis dets karakteristiske fosforylering niveau er ændret, og det er hyperphosphorylated25. I Alzheimers sygdom og nogle andre aldersrelaterede neurodegenerative sygdomme, tau bliver hyperphosphorylated og danner parret spiralformet filamenter og neurofibrillary tangles26,27. Metoder til bestemmelse af tau fosforylering og mikrotubulus bindende er derfor vigtig.
Kolorektal cancer, en aldrende-associerede kræft, er tredje mest hyppigt diagnosticeret kræft og den tredje fremtrædende død-forårsager kræft for både mænd og kvinder28. Tarmkræft er en af de vigtigste død-forårsager kræft i den vestlige verden29. Fordi både tarmkræft og Alzheimers sygdom er forbundet med aldring og begge sker primært i de udviklede lande, hvor folk nyde lignende kostvaner, kan de to sygdomme eller anden måde være korreleret. Hertil kommer, reagerer tau-positive og tau-negative kræftceller forskelligt på kemoterapeutika, fx, paclitaxel16.
Curcumin er en af de vigtigste derivater af Curcuma longa, indisk krydderi gurkemeje30. I århundreder har sydasiatiske populationer forbruges gurkemeje i deres kost på daglig basis. Curcumin er anvendt til behandling af forskellige sygdomme, herunder kolorektal cancer, Alzheimers sygdom, diabetes, cystisk fibrose, inflammatorisk tarmsygdom, gigt, hyperlipidæmi, åreforkalkning og iskæmisk hjertesygdom31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. lithium kan også dræbe kolorektal cancerceller eller forhindre deres spredning39. Lithium kan også bruges til behandling af Alzheimers sygdom40 , da det nedsætter tau sammenlægning og forhindrer dens hyperphosphorylation som observeret i en Transgene mus model41,42,43, 44.
Dette manuskript har til formål at: 1) måle den samlede tau og phospho-tau udtryk niveauer i behandlede celler; 2) Beskriv en fosfatase assay for at måle samlede tau fosforylering; 3) undersøge mikrotubulus-binding af tau; og 4) lokalisere tau af Konfokal mikroskopi i kolorektal cancer cellelinjer behandlet med curcumin eller LiCl. Resultaterne viser, at celle behandling med curcumin, som er en angiveligt god kemoterapeutiske agent for tyktarmskræft, og behandling med LiCl kan reducere udtrykket af begge samlede tau og fosforyleret tau i kolorektal cancer cellelinjer. Disse behandlinger kan også forårsage nukleare translokation af tau. Dog uventet, undlader curcumin at forbedre bindingen af tau at mikrotubuli.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HCT 116 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (EBSS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30024.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LS 015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Coster 3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau 13 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab19030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 708 984 001</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre Centrifuges</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td>MIKRO 200 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1912</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>78246</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubules (MT)</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MT001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C (desiccated)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LB 001-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Model 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay dye reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin (11H10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau (phospho S396) antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab109390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EF0651</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5870</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5871</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 0278</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau-352 human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 9950</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X - 100</td>
			<td>Store at around 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscopy</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells

Mikrotubulus-forbundet protein tau er en neuronal protein, der lokaliserer for det meste i axoner. Generelt er tau afgørende for normale neuronal funktion, fordi det er involveret i mikrotubulus forsamling og stabilisering. Udover neuroner, er tau udtrykt i menneskelige bryst, prostata, gastrisk, kolorektal, og pancreascancer hvor det viser næsten lignende struktur og udøver tilsvarende funktioner som den neuronale tau. Mængden af tau og dens fosforylering kan ændre sin funktion som en stabilisator af mikrotubuli og føre til udviklingen af parret spiralformet filamenter i forskellige neurodegenerative lidelser, såsom Alzheimers sygdom. Bestemmelse af tilstanden fosforylering af tau og dets mikrotubulus-bindende egenskaber er vigtige. Derudover er undersøger den intracellulære lokalisering af tau vigtige i forskellige sygdomme. Dette manuskript detaljer standardprotokoller til måling af tau fosforylering og tau binding til mikrotubuli i kolorektal cancerceller med eller uden curcumin og LiCl behandling. Disse behandlinger kan bruges til at stoppe kræft celle spredning og udvikling. Intracellulære lokalisering af tau er undersøgt ved hjælp af Immunhistokemi og konfokal mikroskopi mens du bruger lavt beløb af antistoffer. Disse assays kan bruges gentagne gange til screening af stoffer, der påvirker tau hyperphosphorylation eller mikrotubulus bindende. Roman therapeutics anvendes til forskellige tauopathies eller relaterede anticancer agenter kan potentielt være karakteriseret ved hjælp af disse protokoller.

Udtryk for total tau og phospho-tau blev undersøgt efter behandling af celler med forskellige koncentrationer af curcumin eller LiCl (figur 1). Behandling af celler med de tre forskellige koncentrationer af curcumin faldt tau udtryk niveauer; dog phospho-tau udtryk steg på behandling med lav koncentration af curcumin men faldt efter behandling af celler med højere curcumin koncentrationer. Anti-phospho-tau (Ser396) blev brugt til påvisning af phospho-tau....

Watch this Scientific Journal Video about Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Assay for fosforylering og mikrotubulus bindende sammen med lokalisering af Tau Protein i kolorektal cancerceller

Dette manuskript beskriver standardprotokoller til måling af tau hyperphosphorylation, måle tau binding til mikrotubuli og lokalisering af intracellulære tau efter medicinsk behandling. Disse protokoller kan bruges gentagne gange til screening af stoffer eller andre stoffer, der er målrettet tau hyperphosphorylation eller mikrotubulus bindende.

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptidkonkurrenceanalyse for phosphoryleringsstedbestemmelse

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering påvisning af LRRK2 aktivitet ved hjælp af SDS-PAGE med en fosfat-bindende Tag

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Påvisning af små GTPase Prenylation og GTP bindende ved hjælp af membran fraktionering og GTPase-forbundet Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Påvisning af Heterodimerization af Protein isoformer ved hjælp af en in Situ nærhed ligatur Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse af proteinfoldning, Transport og nedbrydning i levende celler af radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Human perifert blod Neutrofile Isolation for at forhøre Parkinsons Associated LRRK2 Kinase Pathway ved at vurdere Rab10 fosforylering

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende enheder (SUBEs) som værktøjer til berigelse, isolation, identifikation og karakterisering af SUMO Proteome i leverkræft

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Et optimeret enkeltmolekyle pull-down assay til kvantificering af proteinfosforylering

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...