Name: assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells
Uploaded: 2017-10-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

Diese Forschung wurde durchgeführt im Rahmen des Projekts mit dem Titel "Entwicklung und Industrialisierung von hochwertigen kosmetischen Rohstoffen aus marine Mikroalgen", durch das Ministerium der Ozeane und Fischerei, Korea gefördert und durch einen intramuralen Grant (2Z04930 unterstützt wurde) KIST Gangneung Institute of Naturprodukte.

1. Vorbereitung der Reagenzien <ol><li>fügen Sie 10 µL (1 mM) Phenylmethylsulfonyl Fluorid Lösung, 10 µL Protease-Inhibitor-cocktail-Lösung (1 X 100 X lagermäßig) und 10 µL (1 X 100 X lagermäßig) Phosphatase Inhibitor cocktail Lösung 1 mL 1 X radioimmunoprecipitation (RIPA) Testpuffer komplette RIPA Lyse Puffer vorzubereiten.</li>
	<li>Vorbereitung 10 x allgemeine Tubulin Puffer (PEM) Puffer.
	<ol><li>Add 800 mM (6,0474 g) Piperazin-N-N &#39; - Bis - 2-Ethanesulfonic Säure, 10 mM (95,1 mg)...

Dieses Manuskript verschiedenen verfahrensrechtliche Voraussetzungen für die Erkennung von insgesamt Tau etabliert und phosphoryliert Tau in colorectal Krebszellen mit Curcumin und LiCI behandelt. Um den Gesamtstatus der Phosphorylierung des Tau in Proteinproben zu beurteilen, wurde eine Phosphatase-Assay beschrieben. Dieser Assay kann möglicherweise verwendet werden, um den Status der Phosphorylierung von jedem Protein untersuchen.
Dieser Test basiert auf dem Prinzip, die Protein bewegt sic...

Tau wurde ursprünglich als hitzebeständig Mikrotubuli-assoziierten Protein identifiziert, das Co gereinigtem Tubulin1war. Tau wird ausschließlich in höheren Eukaryoten2,3,4angegeben. Die Hauptfunktion des Tau ist, Mikrotubuli Montage1,5,6zu kontrollieren. Es trägt auch zur Polymerisation von Mikrotubuli7, axonalen Transport8, Veränderungen der axonalen Durchmesser9, Bildung von Neurom Polarität und Neurodegeneration10. Tau fungiert auch als Protein Gerüst, einige Signalwege zu kontrollieren. Ratte Gehirn Studien deuten darauf hin, dass Tau Neuron-spezifische und dass es in erster Linie in Axone11lokalisiert. Da Tau für Mikrotubuli Polymerisation und neuronale Entwicklung unabdingbar ist, war Tau vermutet, um eine wichtige Rolle in der axonalen Entwicklung in das zentrale Nervensystem; Diese Hypothese wurde später von in Vitro und in Vivo Experimente verifiziert. Neben der Neuronen drückt sich Tau in verschiedenen nicht-neuronale Zellen, einschließlich Leber, Niere und Muskel Zellen12,13. Tau drückt sich auch in menschlichen Brust-, Prostata-, Dickdarm-, Magen-, und pankreatischer Krebs Zelle Linien und Gewebe14,15,16,17,18, 19. Tau findet sich auch in Einbeziehung Körper Myositis als verdrehte Tubulofilaments Einschlusskörperchen20.
Tau kann mehrere post-translationalen Modifikationen vornehmen. Phosphorylierung ist alle post-translationalen Modifikationen die am weitesten verbreitete. Erhöhten Tau Phosphorylierung verringert seine Affinität für Mikrotubuli, schließlich das Zellskelett zu destabilisieren. Fünfundachtzig Phosphorylierung Websites wurden in Tau-Protein isoliert von Hirngewebe menschlichen Alzheimer-Krankheit beschrieben. Dieser Seiten sind 53 % Serin, 41 % Threonin und nur 6 % Tyrosin Rückstände21,22,23. Tau-Phosphorylierung wirkt sich auf die Lokalisierung, Funktion, Bindung, Löslichkeit und seiner Anfälligkeit für andere post-translationalen Modifikationen. Auch Tau Phosphorylierung um mehr als die normale Ausdehnung (oder vollständig gesättigt mit Phosphatgruppen) ist bekannt als Hyperphosphorylierung, die strukturelle und funktionelle Merkmale der Alzheimer-Krankheit24repliziert. Tau unterhält Funktionsfähigkeit des axonalen Mikrotubuli und sorgt für normale neuronale Funktion unter physiologischen Bedingungen. Hyperphosphoryliertem Tau schlägt jedoch fehl, eine gut organisierte Mikrotubuli binden, was neuronaler Verlust wegen Mikrotubuli Demontage beizubehalten. Ein normales Niveau von Tau Phosphorylierung sind erforderlich für die ordnungsgemäße Funktionsweise Tau, aber Tau nicht, normal zu funktionieren, wenn seine charakteristische Phosphorylierung-Ebene verändert wird und wenn es hyperphosphoryliertem25. In der Alzheimer-Krankheit und einigen anderen altersbedingten neurodegenerativen Erkrankungen Tau wird hyperphosphoryliertem und bildet die gepaarten spiralförmigen Fäden und neurofibrillären Verschlingungen26,27. Daher sind die Methoden zur Bestimmung von Tau Phosphorylierung und Mikrotubuli binden wichtig.
Colorectal Krebs, eine Alterung verbundenen Krebs ist die dritte am häufigsten diagnostizierte Krebs und der dritte prominente Tod verursacht Krebs für Männer und Frauen28. Darmkrebs ist eine der wichtigsten Tod verursachen Krebserkrankungen in der westlichen Welt29. Weil colorectal Krebs und Alzheimer-Krankheit mit Altern verbunden sind, und beides vor allem in den entwickelten Ländern geschieht, wo die Menschen ähnliche Ernährungsgewohnheiten genießen, können die beiden Krankheiten irgendwie korreliert werden. Darüber hinaus reagieren Tau-Positive und Tau-Negative Krebszellen unterschiedlich auf Chemotherapeutika, z.B., Paclitaxel16.
Curcumin ist eines der wichtigsten Derivate von Curcuma Longa, die indische Gewürz Kurkuma30. Jahrhundertelang haben die asiatische Populationen Kurkuma in ihrer Ernährung auf einer täglichen Basis verbraucht. Curcumin ist zur Behandlung von verschiedenen Krankheiten wie Darmkrebs, Alzheimer-Krankheit, Diabetes, Mukoviszidose, entzündliche Darm-Krankheit, Arthritis, Hyperlipidämie, Arteriosklerose und ischämischen Herzkrankheiten31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. Lithium auch colorectal Krebszellen zu töten oder zu verhindern, dass ihre Verbreitung39. Lithium kann auch verwendet werden, für die Behandlung von Alzheimer-Krankheit40 wie es Tau Aggregation verringert und die Hyperphosphorylierung verhindert wie in einem transgenen Maus Modell41,42,43beobachtet, 44.
Dieses Manuskript soll: 1) messen Sie die Gesamt-Tau und Phospho-Tau Ausdruck Niveaus im behandelten Zellen; (2) beschreiben Sie eine Phosphatase Test zur Messung der gesamten Tau Phosphorylierung; (3) Mikrotubuli-Bindung von Tau zu prüfen; und 4) lokalisieren Tau konfokalen Mikroskopie in colorectal Krebs-Zelllinien mit Curcumin oder LiCI behandelt. Ergebnisse zeigen, dass Zelltherapie mit Curcumin, die einen vermeintlich guten Chemotherapeutikum für Darmkrebs und Behandlung mit LiCI reduzieren Ausdruck der beiden total Tau und Tau in colorectal Krebs-Zelllinien phosphoryliert. Diese Behandlungen verursachen auch nukleare Translokation von Tau. Jedoch nicht unerwartet, Curcumin, Bindung von Tau zu Mikrotubuli zu verbessern.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HCT 116 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (EBSS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30024.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LS 015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Coster 3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau 13 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab19030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 708 984 001</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre Centrifuges</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td>MIKRO 200 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1912</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>78246</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubules (MT)</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MT001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C (desiccated)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LB 001-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Model 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay dye reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin (11H10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau (phospho S396) antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab109390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EF0651</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5870</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5871</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 0278</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau-352 human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 9950</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X - 100</td>
			<td>Store at around 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscopy</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells

Die Mikrotubuli-assoziierten Protein Tau ist ein neuronalen Protein, das vor allem in Axone lokalisiert. Im Allgemeinen ist Tau für normale neuronalen funktionieren, da es bei der Montage von Mikrotubuli und Stabilisierung beteiligt ist. Neben Neuronen ist in menschlichen Brust-, Prostata-, Magen-, Darm-, und Pankreaskarzinome wo es zeigt fast ähnlichen Struktur und ähnliche Funktionen ausübt, als die neuronalen Tau Tau ausgedrückt. Die Höhe der Tau und die Phosphorylierung kann ändern ihre Funktion als Stabilisator von Mikrotubuli und führte zur Entwicklung der gekoppelten spiralförmigen Filamente in verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer. Ermittlung des Tau und die Mikrotubuli-Bindungseigenschaften Phosphorylierung ist wichtig. Darüber hinaus ist es wichtig bei verschiedenen Krankheiten, untersuchen die intrazelluläre Lokalisation der Tau. Dieses Manuskript Details Standardprotokolle zur Messung der Phosphorylierung von Tau und Tau Bindung an Mikrotubuli in colorectal Krebszellen mit oder ohne Curcumin und LiCI Behandlung. Diese Behandlungen können eingesetzt werden, um Krebs Zellproliferation und Entwicklung zu stoppen. Intrazelluläre Lokalisation der Tau wird mithilfe von Immunohistochemistry und konfokalen Mikroskopie mit geringen Mengen von Antikörpern untersucht. Diese Tests können wiederholt verwendet werden, für das screening von Verbindungen, die Tau Hyperphosphorylierung oder Mikrotubuli Bindung auswirken. Neuer Therapeutika für verschiedene Tauopathies oder Verwandte Anti-Krebs-Agenten können potenziell charakterisiert werden, mit Hilfe dieser Protokolle.

Ausdruck der gesamten Tau und Phospho-Tau wurde geprüft, nach der Behandlung der Zellen mit verschiedenen Konzentrationen von Curcumin oder LiCI (Abbildung 1). Behandlung der Zellen mit den drei verschiedenen Konzentrationen von Curcumin verringerte Tau Ausdruck; Phospho-Tau Ausdruck erhöht bei der Behandlung mit geringen Konzentration von Curcumin jedoch verringerte sich auf Behandlung von Zellen mit höheren Konzentrationen von Curcumin. Anti-Phospho-Tau ...

Watch this Scientific Journal Video about Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Test zur Phosphorylierung und Mikrotubuli binden zusammen mit Lokalisierung des Tau-Proteins in Colorectal Krebszellen

Dieses Manuskript beschreibt Standardprotokolle zur Messung der Hyperphosphorylierung Tau, Tau Bindung an Mikrotubuli und Lokalisierung von intrazellulären Tau nach medikamentösen Behandlungen zu messen. Diese Protokolle können wiederholt verwendet werden, für das screening von Drogen oder andere Substanzen, die auf Tau Hyperphosphorylierung oder Mikrotubuli binden.

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptid-Konkurrenz-Assay zur Phosphorylierungsbestimmung

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Forschung

Biochemie

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 Phosphorylierung Erkennung von LRRK2 Aktivität mit SDS-PAGE mit einem Phosphat-Bindung

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Erkennung von kleine GTPase Prenylation und GTP binden mit Membran Fraktionierung und GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Erkennung von Heterodimerization Protein-Isoformen, die mit einem in Situ Nähe Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry die Bindung Dynamik der Phospholipid-bindende Protein Annexin A2, solide unterstützt Lipid Bilayer mit einem Quarz-Resonator zu studieren

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hohe Empfindlichkeit Messung der Transkription Faktor-DNA verbindlichen Affinitäten durch wettbewerbsfähige Titration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse der Proteinfaltung, Transport und Abbau in lebenden Zellen durch radioaktive Puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Human periphere Blut Neutrophil Isolation für die Verhör der Parkinson-assoziierten LRRK2 Kinase Weg durch Bewertung Rab10 Phosphorylierung

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities (SUBEs) als Werkzeuge zur Anreicherung, Isolierung, Identifizierung und Charakterisierung des SUMO-Proteoms bei Leberkrebs

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Ein optimierter Einzelmolekül-Pulldown-Assay zur Quantifizierung der Proteinphosphorylierung

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...