Name: assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells
Uploaded: 2017-10-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

מחקר זה בוצע כפי חלק מהפרוייקט שכותרתו 'פיתוח ו ה תיעוש של חומרי גלם קוסמטיים ערך גבוה מ microalgae ימית', ממומן על ידי משרד של אוקיינוסים, חלוצת, קוריאה, נתמך על ידי מענק מגזר (2Z04930) ממוסד KIST Gangneung של מוצרים טבעיים.

1. הכנה של ריאגנטים µL <ol><li>µL להוסיף 10 בפתרון פלואוריד phenylmethylsulfonyl (1 מ מ), 10 (1 x 100 x מניות) של פתרון קוקטייל של מעכבי פרוטאז, µL 10 (1 x 100 x מניות) של פוספטאז פתרון קוקטייל מעכב 1 מ"ל 1 x radioimmunoprecipitation assay (ריפה) המאגר כדי להכין מאגר שלם של פירוק ריפה.</li>
	<li>הכן 10 x טובולין כללי מאגר (PEM) מאגר.
	<ol><li>?...

כתב יד זה הוקמה תנאים פרוצדורליים שונים לגילוי טאו הכולל ואת phosphorylated טאו בתאי סרטן המעי הגס שטופלו כורכומין, LiCl. כדי להעריך את המצב זרחון הכוללת של טאו בדגימות חלבון, תוארה של assay פוספטאז. Assay הזה יכול לשמש באופן פוטנציאלי כדי לבחון את המצב זירחון של כל חלבון.
Assay זו מבוססת על ה...

טאו זוהה במקור בחום-היציב הקשורים microtubule חלבון זה היה מזוכך במשותף עם טובולין1. טאו מתבטא באופן בלעדי גבוה פרוקריוטים2,3,4. הפונקציה העיקרית של טאו היא לשלוט microtubule הרכבה1,5,6. זה גם תורם פלמור של microtubules7, תחבורה עצב8, שינויים בעצב בקוטר9, היווצרות נירומה קוטביות, הקשורים ניוון מוחיים10. טאו פועלת גם בדומה לפיגום חלבון כדי לשלוט איזה איתות המסלולים. עכברוש המוח מחקרים מראים את טאו הוא נוירון ספציפי, זה בעיקר. רגישה אקסונים11. מכיוון טאו הוא חיוני microtubule הפילמור ופיתוח עצביים, טאו היה שיערו לשחק תפקיד מרכזי בהתפתחות עצב במערכת העצבים המרכזית; השערה זו היה אח כ אומתה על ידי ניסויים במבחנה , ויוו . בנוסף הנוירונים, טאו מתבטא תאים שאינם עצביים שונים, כולל הכבד, הכליה שרירים תאים12,13. טאו, מתבטאת גם אנושי השד, הערמונית, המעי הגס, קיבה, ו סרטן הלבלב תא קווים ורקמות14,15,16,17,18, 19. טאו נמצא גם הכללה-הגוף לומבגו כמו tubulofilaments מעוות הכללה גופות20.
טאו עשוי לבצע מספר שינויים post-translational. של כל השינויים post-translational, זרחון היא הנפוצה ביותר. טאו מוגברת זרחון מקטין את האהדה microtubules, בסופו של דבר יציב את שלד התא. אתרי זירחון 85 תוארו חלבון טאו מבודד ברקמות המוח האנושי מחלת אלצהיימר. האתרים האלה 53% מהווים סרין טראונין 41%, רק 6% טירוזין שאריות21,22,23. טאו זרחון משפיעה על לוקליזציה שלה, פונקציה, איגוד, המסיסות, והרגישות שלו כדי שינויים post-translational אחרים. גם טאו זירחון כדי יותר במידה נורמלית (או רווי לחלוטין עם קבוצות פוספט) המכונה hyperphosphorylation משכפל מאפיינים מבניים ופונקציונליים של מחלת האלצהיימר24. טאו שומר על התפקוד התקין של microtubules עצב ומבטיחה לתפקוד תקין עצביים בתנאים פיזיולוגיים. עם זאת, טאו hyperphosphorylated מצליח לשמור על איגוד microtubule מאורגן היטב, גרימת הפסד עצביים בגלל microtubule פירוק. רמות נורמליות של טאו זרחון נדרשים עבור טאו תקין בתפקוד, אך טאו לא יצליח לתפקד באופן נורמלי, אם רמת זירחון האופייני שלו היא שונה, ואם זה hyperphosphorylated25. מחלת אלצהיימר, הפרעות ניווניות הקשורות לגיל אחרים, טאו הופך hyperphosphorylated, יוצר חוטים לוליינית לזווג בין קשרים neurofibrillary26,27. לכן, שיטות לקביעת טאו זרחון ואיגוד microtubule חשובים.
סרטן המעי הגס, סרטן הקשורים להזדקנות, הוא שהשלישי מרבה אובחן סרטן וסרטן את השלישי בולטים גורמי המוות עבור גברים ונשים כאחד28. סרטן המעי הגס הוא אחד של סרטן סיבת המוות העיקרית העולם המערבי29. כי סרטן המעי הגס וגם מחלת אלצהיימר קשורים עם ההזדקנות ובמקרה שניהם בעיקר במדינות המפותחות בה אנשים נהנים הרגלי התזונה דומה, ייתכן ושתי המחלות איכשהו בקורלציה. בנוסף, תאים סרטניים טאו-חיוביים ושליליים -טאו להגיב באופן שונה על סוכנים כימותרפיות, למשל, פקליטקסל16.
כורכומין הוא אחד נגזרות הראשי של כורכום longa, כורכום תבלין הודי30. במשך מאות שנים, אוכלוסיות בדרום אסיה יש לצרוך כורכום בדיאטה שלהם על בסיס יומי. כורכומין משמש לטיפול במחלות שונות, כולל סרטן המעי הגס, מחלת אלצהיימר, סוכרת, סיסטיק פיברוזיס, מחלות מעי דלקתיות, דלקת פרקים, היפרליפידמיה, טרשת עורקים, מחלת לב איסכמית31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. ליתיום יכול גם להרוג תאים סרטן המעי הגס או למנוע את התפשטות39. ליתיום יכול לשמש גם לטיפול מחלת אלצהיימר40 כפי שהוא מקטין צבירת טאו מונע hyperphosphorylation שלה, כפי שנצפתה על העכבר הטרנסגניים דגם41,42,43, 44.
כתב יד זה שואף: 1) למדוד את טאו הכולל ואת רמות ביטוי פוספו-טאו בתאים שטופלו; 2) לתאר וזמינותו פוספטאז למדוד זרחון טאו הכללית; 3) לבחון microtubule-איגוד של טאו; . ו-4) בתרגום טאו מאת מיקרוסקופיה קונפוקלית בשורות תאים סרטן המעי הגס, מטופלים עם כורכומין או LiCl. תוצאות חושפים כי טיפול תאי עם כורכומין, אשר הוא סוכן טוב כביכול כימותרפיות לסרטן המעי הגס, טיפול עם LiCl יכול להפחית את הביטוי של טאו הכולל שני, phosphorylated טאו בשורות תאים סרטן המעי הגס. טיפולים אלה יכול גם לגרום רוברטסונית הגרעין של טאו. עם זאת, באופן בלתי צפוי, כורכומין נכשל לשפר את הכריכה של טאו כדי microtubules.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HCT 116 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (EBSS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30024.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LS 015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Coster 3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau 13 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab19030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 708 984 001</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre Centrifuges</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td>MIKRO 200 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1912</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>78246</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubules (MT)</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MT001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C (desiccated)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LB 001-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Model 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay dye reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin (11H10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau (phospho S396) antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab109390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EF0651</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5870</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5871</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 0278</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau-352 human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 9950</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X - 100</td>
			<td>Store at around 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscopy</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells

טאו חלבונים הקשורים microtubule הוא חלבון עצביים רגישה בעיקר ב אקסונים. בדרך כלל טאו הוא חיוני לתפקוד נורמלי עצביים מכיוון מעורב microtubule הרכבה, מייצב. מלבד הנוירונים, טאו מתבטא בשד האנושי, הערמונית, קיבה, המעי הגס, סרטן הלבלב איפה זה מציג מבנה דומה כמעט ולא מפעילה פונקציות דומות כמו טאו עצביים. הסכום של טאו שלה זרחון יכול לשנות את תפקידה בתור מייצב של microtubules ולאחר להוביל להתפתחות של חוטים לוליינית לזווג הפרעות ניווניות שונות, כגון מחלת אלצהיימר. קביעת המדינה זירחון של טאו ומאפייניה microtubule מחייב חשוב. בנוסף, בחינת ההתאמה תאיים של טאו היא חשובה מחלות שונות. זה כתב היד פרטים פרוטוקולים סטנדרטיים עבור מדידת זרחון טאו טאו מחייב microtubules בתאי סרטן המעי הגס עם או בלי כורכומין וטיפול LiCl. טיפולים אלה יכולים לשמש כדי לעצור את התפשטות תאים סרטן ופיתוח. לוקליזציה תאיים של טאו נבדק על-ידי שימוש אימונוהיסטוכימיה מיקרוסקופיה קונפוקלית תוך שימוש כמויות נמוכות של נוגדנים. מבחני אלה ניתן להשתמש שוב ושוב לסינון תרכובות המשפיעים על hyperphosphorylation טאו או microtubule מחייב. הריפוי משמש tauopathies שונים או סוכנים נגד סרטן הקשורים יכול באופן פוטנציאלי להתאפיין באמצעות פרוטוקולים אלה.

ביטוי הכולל טאו טאו פוספו נבדקה לאחר טיפול תאי עם ריכוזים שונים של כורכומין או LiCl (איור 1). טיפול של תאים עם שלושה ריכוזים שונים של כורכומין ירד טאו רמות הביטוי; עם זאת, הביטוי פוספו-טאו מוגברת בעת טיפול עם ריכוז נמוך של כורכומין אך ירד על טיפול תאים עם ריכוז ...

Watch this Scientific Journal Video about Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

וזמינותו של זרחון ואיגוד Microtubule יחד עם לוקליזציה של חלבון טאו בתאי סרטן המעי הגס

כתב יד זה מתאר פרוטוקולים סטנדרטיים למדידת hyperphosphorylation טאו, מדידת מחייב טאו microtubules, לוקליזציה של טאו תאיים בעקבות טיפולים תרופות. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש שוב ושוב לסינון סמים או תרכובות אחרות המכוונות איגוד hyperphosphorylation או microtubule טאו.

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 זיהוי זרחון על-ידי פעילות LRRK2 באמצעות מרחביות-דף עם תג מחייב פוספט

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

זיהוי של GTPase Prenylation קטן ו GTP איגוד באמצעות ממברנה Fractionation ו GTPase-מקושרים Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

זיהוי של Heterodimerization של חלבון איזופורמים שימוש בחיי עיר הקרבה מצדו Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipative ללמוד את הדינמיקה איגוד של פוספוליפיד איגוד חלבון Annexin A2 כדי Bilayers השומנים הנתמכות על-ידי מוצק באמצעות מהוד קוורץ

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

רגישות גבוהה מדידה של שעתוק הזיקות איגוד מקדם-DNA על ידי טיטור תחרותי באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

ניתוח של קיפול חלבונים, תחבורה, והשפלה בתאים חיים על ידי הדופק רדיואקטיבי צ'ייס

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

דם היקפי הדם נויטרופילים בידוד עבור חקירת פרקינסון הקשורים LRRK2 קינאז מסלול על ידי הערכת Rab10 זירחון

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

מחייב סומו ישויות (SUBEs) ככלים עבור העשרה, בידוד, זיהוי, ואפיון של פרוטאום סומו בסרטן הכבד

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

בדיקה ממוטבת של משיכה במולקולה בודדת לכימות של זרחון חלבונים

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...