Name: assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells
Uploaded: 2017-10-10T12:30:00
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इस शोध के भाग के रूप में किया गया था ' शीर्षक परियोजना के विकास और औद्योगिकीकरण के उच्च मूल्य कॉस्मेटिक कच्चे माल से समुद्री शैवाल ', के मंत्रालय द्वारा वित्त पोषित महासागरों और मत्स्य पालन, कोरिया, और एक अंदर अनुदान द्वारा समर्थित था (2Z04930) प्राकृतिक उत्पादों के आइएसटी Gangneung संस्थान से ।

1. रिएजेंट की तैयारी कर रहे हैं <ol> <li> Add 10 & #181; l का (1 mM) phenylmethylsulfonyl फ्लोराइड सॉल्यूशन, 10 & #181; l (100x स्टॉक से 1x) को छेड़ने वाले अवरोधक कॉकटेल समाधान, और 10 & #181; l (100x स्टॉक से 1x) फॉस्फेट के बाधा कॉकटेल समाधान 1x radioimmunoprecipitation परख के 1 म?...

इस पांडुलिपि curcumin और LiCl के साथ इलाज कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं में कुल ताऊ और phosphorylated ताऊ का पता लगाने के लिए अलग प्रक्रियात्मक शर्तों की स्थापना की । प्रोटीन के नमूनों में ताऊ की समग्र फास्फारिलीकरण स्थित?...

ताऊ मूल रूप से एक ऊष्मा-स्थिर microtubule-जुड़े प्रोटीन के रूप में पहचाना जाता था जो कि tubulin1के साथ सह-शुद्धि थी । ताऊ ने विशेष रूप से उच्च eukaryotes2,3,4में व्यक्त की है । ताऊ का मुख्य कार्य microtubule असेंबली1,5,6को नियंत्रित करना है । यह भी microtubules7, axonal परिवहन8, axonal व्यास9में परिवर्तन, ंयुरोमा ध्रुवीकरण के गठन, और neurodegeneration10के बहुलकीकरण के लिए योगदान देता है । ताऊ भी कुछ संकेत रास्ते को नियंत्रित करने के लिए एक प्रोटीन पाड़ के रूप में कार्य करता है । चूहे मस्तिष्क अध्ययन का सुझाव है कि ताऊ ंयूरॉन है और विशिष्ट है कि यह मुख्य रूप से axons11में स्थानीयकरण । क्योंकि ताऊ microtubule बहुलकीकरण और न्यूरॉन विकास के लिए आवश्यक है, ताऊ केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में axonal विकास में एक प्रमुख भूमिका निभाने के लिए परिकल्पना की गई थी; इस परिकल्पना को बाद में इन विट्रो में और वीवो प्रयोगों में सत्यापित किया गया । न्यूरॉन्स के अलावा, ताऊ जिगर, गुर्दे, और मांसपेशियों की कोशिकाओं को12,13सहित अलग गैर न्यूरॉन कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है. ताऊ मानव स्तन, प्रोस्टेट, कोलोरेक्टल, गैस्ट्रिक, और अग्नाशय के कैंसर सेल लाइनों और ऊतकों में भी व्यक्त किया जाता है14,15,16,17,18, 19. ताऊ का भी समावेश में पाया जाता है-शरीर myositis के रूप में मुड़ tubulofilaments में शामिल निकायों20.
ताऊ कई पोस्ट शोधों के संशोधनों को ले सकता है । सभी के बाद अनुवाद संशोधन, फास्फारिलीकरण सबसे आम है । बढ़ी हुई ताऊ फास्फारिलीकरण microtubules के लिए अपने संबध घटाता है, अंत में cytoskeleton स्थिर । ८५ फास्फारिलीकरण साइटें तौ प्रोटीन मानव अल्जाइमर रोग मस्तिष्क के ऊतकों से पृथक में वर्णित किया गया है । इन साइटों की, ५३% serine का गठन, ४१% threonine, और केवल 6% tyrosine अवशेषों21,22,23। ताऊ फास्फारिलीकरण अपने स्थानीयकरण, समारोह, बंधन, घुलनशीलता, और इसके अन्य पद-शोधों के संशोधनों को झेलते हुए प्रभावित करता है. इसके अलावा ताऊ फास्फारिलीकरण सामांय सीमा से अधिक (या पूरी तरह फॉस्फेट समूहों के साथ संतृप्त) hyperphosphorylation के रूप में जाना जाता है कि अल्जाइमर रोग के संरचनात्मक और कार्यात्मक विशेषताओं24प्रतिकृति है । ताऊ axonal microtubules के समुचित कार्य को बनाए रखता है और शारीरिक स्थितियों के तहत सामान्य न्यूरॉन कार्य सुनिश्चित करता है । हालांकि, hyperphosphorylated ताऊ एक अच्छी तरह से संगठित microtubule बंधन बनाए रखने के लिए विफल रहता है, क्योंकि microtubule विधानसभा के न्यूरॉन नुकसान के कारण. ताऊ फास्फारिलीकरण के सामान्य स्तर उचित ताऊ कामकाज के लिए आवश्यक हैं, लेकिन ताऊ सामान्य रूप से कार्य करने में विफल रहता है अगर इसकी विशेषता फास्फारिलीकरण स्तर बदल गया है और अगर यह hyperphosphorylated है25। अल्जाइमर रोग और कुछ अन्य उम्र से संबंधित neurodegenerative विकारों में, ताऊ hyperphosphorylated हो जाता है और युग्मित पेचदार रेशा और neurofibrillary पेचीदा26,27रूपों. इस प्रकार, ताऊ फास्फारिलीकरण और microtubule बंधन निर्धारित करने के लिए तरीके महत्वपूर्ण हैं ।
कोलोरेक्टल कैंसर, एक उंर से जुड़े कैंसर, तीसरी सबसे अक्सर निदान कैंसर और तीसरा प्रमुख मौत दोनों पुरुषों और महिलाओं को28के लिए कैंसर के कारण है । कोलोरेक्टल कैंसर मुख्य मौत के कारण पश्चिमी दुनिया में कैंसर के29में से एक है । क्योंकि दोनों कोलोरेक्टल कैंसर और अल्जाइमर रोग उंर बढ़ने के साथ जुड़े रहे है और दोनों विकसित देशों में मुख्य रूप से हो जहां लोगों को इसी तरह के आहार की आदतों का आनंद, दो रोगों किसी भी तरह से संबद्ध किया जा सकता है । इसके अलावा, ताऊ-पॉजिटिव और ताऊ-नेगेटिव कैंसर कोशिकाएं कीमोथेरेपी एजेंटों को अलग से जवाब देती हैं, उदा, paclitaxel16.
Curcumin, भारतीय मसाला हल्दी30 अवती लोंगाके मुख्य डेरिवेटिव में से एक है । सदियों से दक्षिण एशियाई आबादी एक दैनिक आधार पर अपने आहार में हल्दी का सेवन किया है । Curcumin में कोलोरेक्टल कैंसर, अल्जाइमर रोग, मधुमेह, सिस्टिक फाइब्रोसिस, भड़काऊ आंत्र रोग, गठिया, hyperlipidemia, atherosclerosis, और कोरोनरी हृदय रोग सहित विभिन्न रोगों का इलाज किया जाता है31, ३२ , ३३ , ३४ , ३५ , ३६ , ३७ , ३८. लिथियम भी कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं को मार या उनके प्रसार३९को रोकने कर सकते हैं । लिथियम भी अल्जाइमर रोग के इलाज के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है४० के रूप में यह ताऊ एकत्रीकरण कम हो जाती है और इसकी hyperphosphorylation के रूप में एक ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में मनाया४१,४२,४३, ४४.
इस पांडुलिपि का उद्देश्य: 1) इलाज कोशिकाओं में कुल ताऊ और phospho-ताऊ अभिव्यक्ति के स्तर को मापने; 2) एक फॉस्फेट परख का वर्णन करने के लिए समग्र ताऊ फास्फारिलीकरण उपाय; ३) तौ के microtubule-बंधन की जांच; और 4) curcumin या LiCl के साथ इलाज कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनों में फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा information तौ । परिणाम curcumin के साथ कि कोशिका उपचार पता चलता है, जो पेट के कैंसर के लिए एक माना जाता है अच्छा कीमोथेरेपी एजेंट है, और LiCl के साथ इलाज के दोनों कुल ताऊ और phosphorylated ताऊ कोलोरेक्टल कैंसर सेल लाइनों में की अभिव्यक्ति को कम कर सकते हैं । ये उपचार ताऊ के न्यूक्लियर translocation का कारण भी बन सकते हैं । हालांकि, अनपेक्षित रूप से, curcumin microtubules करने के लिए ताऊ की बाइंडिंग में सुधार करने के लिए विफल रहता है ।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HCT 116 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (EBSS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30024.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LS 015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Coster 3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau 13 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab19030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 708 984 001</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre Centrifuges</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td>MIKRO 200 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1912</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>78246</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubules (MT)</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MT001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C (desiccated)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LB 001-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Model 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay dye reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin (11H10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau (phospho S396) antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab109390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EF0651</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5870</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5871</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 0278</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau-352 human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 9950</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X - 100</td>
			<td>Store at around 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscopy</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells

microtubule-जुड़े प्रोटीन ताऊ एक न्यूरॉन प्रोटीन है कि axons में ज्यादातर स्थानीयकृत है । आम तौर पर ताऊ सामान्य न्यूरॉन कामकाज के लिए आवश्यक है क्योंकि यह microtubule विधानसभा और स्थिरीकरण में शामिल है. न्यूरॉन्स के अलावा, ताऊ मानव स्तन, प्रोस्टेट, गैस्ट्रिक, कोलोरेक्टल, और अग्नाशय के कैंसर में व्यक्त की है जहां यह लगभग इसी तरह की संरचना से पता चलता है और न्यूरॉन ताऊ के रूप में इसी तरह के कार्यों डालती है. ताऊ की राशि और उसके फास्फारिलीकरण microtubules के एक स्थिरता के रूप में अपने कार्य को बदल सकते हैं, और अल्जाइमर रोग जैसे विभिंन neurodegenerative विकारों में युग्मित पेचदार रेशा के विकास के लिए सीसा । ताऊ के फास्फारिलीकरण राज्य का निर्धारण और उसकी microtubule-बाध्यकारी विशेषताएँ महत्वपूर्ण हैं. इसके अलावा, ताऊ के intracellular स्थानीयकरण की जांच विभिन्न रोगों में महत्वपूर्ण है । इस पांडुलिपि के साथ या curcumin और LiCl उपचार के बिना कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं में microtubules के लिए ताऊ फास्फारिलीकरण और ताऊ बाइंडिंग को मापने के लिए मानक प्रोटोकॉल का विवरण । इन उपचार कैंसर सेल प्रसार और विकास को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । ताऊ का Intracellular स्थानीयकरण immunohistochemistry और फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए एंटीबॉडी की कम मात्रा का उपयोग करके जांच की है । इन परख दोहराव यौगिकों कि ताऊ hyperphosphorylation या microtubule बंधन को प्रभावित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । उपंयास चिकित्सकीय विभिंन tauopathies या संबंधित विरोधी एजेंटों के लिए इस्तेमाल किया संभावित इन प्रोटोकॉल का उपयोग कर विशेषता हो सकती है ।

curcumin या LiCl (चित्रा 1) की विभिन्न सांद्रता वाले कक्षों के इलाज के बाद कुल ताऊ और phospho-ताऊ की अभिव्यक्ति की जांच की गई । curcumin कमी ताऊ अभिव्यक्ति स्तर की तीन अलग सांद्रता के साथ कोशिकाओं के ?...

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Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

फास्फारिलीकरण के लिए परख और कोलोरेक्टल कैंसर की कोशिकाओं में ताऊ प्रोटीन के स्थानीयकरण के साथ बाध्यकारी Microtubule

यह पांडुलिपि ताऊ hyperphosphorylation को मापने के लिए मानक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, ताऊ बंधन को मापने microtubules, और intracellular ताऊ के स्थानीयकरण निंनलिखित दवा उपचार । इन प्रोटोकॉल दोहराए दवाओं या अंय यौगिकों कि लक्ष्य ताऊ hyperphosphorylation या microtubule बाध्यकारी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

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Research

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Biochemistry

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