Name: assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells
Uploaded: 2017-10-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

Questa ricerca è stata eseguita come parte del progetto dal titolo "Sviluppo e industrializzazione di alto valore materie prime cosmetiche da microalghe marine", finanziato dal Ministero degli oceani e pesca, Corea e fu sostenuta da una sovvenzione intramurale (2Z04930) da KIST Gangneung Istituto di prodotti naturali.

1. preparazione dei reagenti <ol><li>aggiungere 10 µ l di soluzione di fluoruro phenylmethylsulfonyl di (1 mM), 10 µ l (1 x da deposito x 100) di soluzione cocktail dell'inibitore di proteasi e 10 µ l (1 x da deposito x 100) di fosfatasi il soluzione cocktail inibitore a 1 mL di tampone di dosaggio (RIPA) x radioimmunoprecipitation 1 per preparare il tampone di lisi completa RIPA.</li>
	<li>Preparare 10 x buffer buffer (PEM) generale tubulina.
	<ol><li>Aggiungi 800mm (6,0474 g) piperazina-N-N &#39;...

Questo manoscritto stabilito diverse condizioni procedurale per la rilevazione totale tau e fosforilato tau in cellule di cancro colorettale trattate con curcumina e LiCl. Per valutare lo stato generale di fosforilazione di tau nei campioni della proteina, è stata descritta un'analisi della fosfatasi. Questo test può potenzialmente utilizzabili per esaminare lo stato di fosforilazione di tutta la proteina.
Questa analisi è basata sul principio che fosforilato proteina mosse più lento del s...

Tau è stata originariamente identificata come una proteina microtubule-collegata di termo-stabile che è stato co-purificata con tubulina1. Tau è espresso esclusivamente in più alti eucarioti2,3,4. La funzione principale di tau è quello di controllare microtubule Assemblea1,5,6. Contribuisce anche alla polimerizzazione dei microtubuli7, trasporto assonale8, cambiamenti nel diametro assonale9, formazione di neuroma polarità e neurodegenerazione10. Tau funge anche da un'impalcatura di proteine per controllare alcune vie di segnalazione. Gli studi del cervello di ratto suggeriscono che tau è neurone-specifico e che localizza principalmente in assoni11. Perché tau è essenziale per la polimerizzazione dei microtubuli e sviluppo neuronale, tau è stata supposta per svolgere un ruolo importante nello sviluppo di axonal nel sistema nervoso centrale; Questa ipotesi è stato successivamente verificato da esperimenti in vitro e in vivo . Oltre ai neuroni, tau è espresso in cellule non neuronali differenti, compreso fegato, rene e muscolo cellule12,13. Tau è espresso anche in umano del seno, della prostata, del colon-retto, gastrica e cancro del pancreas cella linee e tessuti14,15,16,17,18, 19. tau si trova anche nella miosite come twisted tubulofilaments in corpi di inclusione20.
Tau può trasportare parecchie modifiche post-traduzionali. Di tutte le modifiche post-traduzionali, fosforilazione è il più comune. Fosforilazione di tau aumento diminuisce la sua affinità per i microtubuli, infine destabilizzare il citoscheletro. Siti di fosforilazione di ottantacinque sono stati descritti nella proteina tau isolato dai tessuti di cervello umano del morbo di Alzheimer. Di questi siti, 53% costituiscono serina, treonina 41% e solo 6% tirosina residui21,22,23. La fosforilazione di Tau influisce sulla sua localizzazione, funzione, associazione, solubilità e della sua suscettibilità ad altre modificazioni post-traduzionali. Anche la fosforilazione di tau a oltre la misura normale (o completamente saturo con gruppi fosfato) è conosciuto come iperfosforilazione che replica le caratteristiche strutturali e funzionali del morbo di Alzheimer24. Tau mantiene il corretto funzionamento dei microtubuli assonali e assicura il normale funzionamento neuronale in condizioni fisiologiche. Tuttavia, tau iperfosforilata non riesce a mantenere un'associazione ben organizzata dei microtubuli, causando la perdita di un neurone a causa di disassemblaggio dei microtubuli. Sono necessari per tau corretto funzionamento normali livelli di fosforilazione di tau, ma tau non riesce a funzionare normalmente se il livello di fosforilazione caratteristico è alterato e se è hyperphosphorylated25. Nel morbo di Alzheimer e di alcuni altri disordini neurodegenerative relativi all'età, tau diventa hyperphosphorylated e forma i filamenti elicoidali accoppiati e grovigli neurofibrillary26,27. Così, i metodi per determinare la fosforilazione di tau e associazione dei microtubuli sono importanti.
Cancro colorettale, un cancro di invecchiamento-collegato, è che il terzo più frequentemente diagnosticato cancro e il terzo cancro prominente di causa di morte per uomini e donne28. Il cancro colorettale è uno dei cancri più principali causa di morte nel mondo occidentale29. Perché sia cancro colorettale e morbo di Alzheimer sono associate con l'invecchiamento e sia capita soprattutto nei paesi sviluppati, dove le persone godono simili abitudini alimentari, le due malattie possono in qualche modo essere correlate. Inoltre, le cellule tumorali tau-positivi e negativi tau rispondono in modo diverso agli agenti chemioterapeutici, ad es., paclitaxel16.
La curcumina è uno dei principali derivati di Curcuma longa, la curcuma spezia indiana30. Per secoli, popolazioni sud asiatiche hanno consumato curcuma nella loro dieta su base giornaliera. La curcumina è usata per trattare diverse patologie, compreso cancro colorettale, morbo di Alzheimer, diabete, fibrosi cistica, malattie infiammatorie intestinali, artrite, iperlipidemia, aterosclerosi e malattia cardiaca ischemica31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. al litio può anche uccidere le cellule tumorali del colon-retto o prevenire la loro proliferazione39. Litio può essere utilizzato anche per il trattamento del morbo di Alzheimer40 come si diminuisce l'aggregazione di tau e impedisce la sua iperfosforilazione come osservato in un topo transgenico modello41,42,43, 44.
Questo manoscritto si propone di: 1) misurare la tau totale e livelli di espressione di phospho-tau in cellule trattate; 2) descrivere un'analisi della fosfatasi per misurare la fosforilazione di tau complessiva; 3) esaminare microtubule-leganti di tau; e 4) localizzare tau mediante microscopia confocale in linee cellulari di cancro colorettale trattate con curcumina o LiCl. I risultati rivelano che il trattamento delle cellule con la curcumina, che è un agente chemioterapeutico apparentemente buono per tumore del colon, e trattamento con LiCl può ridurre l'espressione di entrambi tau totale e fosforilato tau in linee cellulari di cancro colorettale. Questi trattamenti possono anche causare la traslocazione nucleare di tau. Tuttavia, inaspettatamente, la curcumina non riesce a migliorare associazione di tau i microtubuli.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HCT 116 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (EBSS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30024.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LS 015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Coster 3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau 13 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab19030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 708 984 001</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre Centrifuges</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td>MIKRO 200 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1912</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>78246</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubules (MT)</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MT001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C (desiccated)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LB 001-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Model 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay dye reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin (11H10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau (phospho S396) antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab109390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EF0651</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5870</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5871</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 0278</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau-352 human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 9950</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X - 100</td>
			<td>Store at around 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscopy</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells

Il tau proteina microtubule-collegata è una proteina di un neurone che si localizza principalmente negli assoni. Generalmente il tau è essenziale per il normale funzionamento neuronale perché è coinvolto nella stabilizzazione e microtubuli. Oltre a neuroni, tau è espresso in umano del seno, prostata, gastrica, del colon-retto e cancri del pancreas dove Mostra struttura quasi simile ed esercita funzioni simili come il tau neuronale. La quantità di tau e sua fosforilazione può modificare la sua funzione come stabilizzatore dei microtubuli e portare allo sviluppo di filamenti elicoidali accoppiati in diversi processi neurodegenerativi, come il morbo di Alzheimer. Determinazione dello stato di fosforilazione di tau e le sue caratteristiche di microtubule-leganti è importante. Inoltre, esaminando la localizzazione intracellulare di tau è importante in diverse malattie. Questo manoscritto particolari protocolli standard per la misurazione di fosforilazione di tau e associazione tau i microtubuli in cellule di cancro colorettale con o senza curcumina e trattamento di LiCl. Questi trattamenti possono essere utilizzati per interrompere lo sviluppo e la proliferazione della cellula tumorale. Localizzazione intracellulare di tau è esaminati mediante immunoistochimica e microscopia confocale durante l'utilizzo di basse quantità di anticorpi. Queste analisi possono essere utilizzate ripetutamente per lo screening di composti che influenzano l'iperfosforilazione di tau o associazione dei microtubuli. Approcci terapeutici utilizzati per differenti Taupatie o relativi agenti anticancro potenzialmente possono essere caratterizzati tramite questi protocolli.

Espressione di totale tau e fosfo-tau è stata esaminata dopo aver trattato le cellule con differenti concentrazioni di curcumina o LiCl (Figura 1). Trattamento delle cellule con le tre diverse concentrazioni di curcumina ha fatto diminuire i livelli di espressione di tau; Tuttavia, phospho-tau espressione aumentata dal trattamento con bassa concentrazione di curcumina ma è diminuito al momento trattando le cellule con alte concentrazioni di curcumina. Anti-...

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Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Saggio per la fosforilazione e l'associazione dei microtubuli con localizzazione della proteina Tau in cellule di cancro del colon-retto

Questo manoscritto descrive protocolli standard per la misurazione iperfosforilazione di tau, associazione tau ai microtubuli e la localizzazione intracellulare Tau dopo trattamenti farmacologici di misura. Questi protocolli possono essere utilizzati in modo ripetitivo per lo screening di farmaci o altri composti che ottenere tau iperfosforilazione o dei microtubuli associazione.

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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