Name: assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells
Uploaded: 2017-10-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

이 연구 프로젝트의 일환 '개발 및 해양 미세에서 높은 가치 화장품 원료 물질의 산업화' 라는, 지원 사역의 바다와 수 산, 한국, 그리고 교내 그랜트 (2Z04930)에 의해 지원 되었다 수행 되었다 KIST 강릉 연구소 천연 제품.

1. 시 약의 준비 프로 테아 제 억제 물 칵테일 솔루션, <ol><li>추가 10 µ L (1 mM) phenylmethylsulfonyl 불 소 솔루션, 10의 µ L (1 x 100 x 사진에서)와 인산 가수분해 효소의 10 µ L (1 x 100 x 사진에서) 완전 한 RIPA 세포의 용 해 버퍼 준비 1 x radioimmunoprecipitation 분석 결과 (RIPA) 버퍼의 1 mL에 억제 물 칵테일 솔루션.</li>
	<li>준비 10 일반 tubulin 버퍼 (PEM) 버퍼 x.
	<ol><li>추가 800 mM (6.0474 g) piperazine-N-N &#39;-?...

이 원고 총 타우 감지에 대 한 서로 다른 절차 조건 고 대 장 암 세포 치료 curcumin와 LiCl 타우 phosphorylated. 단백질 견본에서의 전반적인 인 산화 상태를 평가 하기 위해 인산 가수분해 효소 분석 결과 설명 했다. 이 분석 결과 잠재적으로 어떤 단백질의 인 산화 상태 검사를 사용할 수 있습니다.
이 분석 결과 phosphorylated 단백질 이동 비 phosphorylated 상태로 보다 원칙을 기반으로 합?...

타우 원래 공동 tubulin1순화 했다 열 안정 microtubule 관련 단백질으로 확인 되었다. 타우는 높은 진핵생물2,,34에 독점적으로 표현 된다. 주요 기능 microtubule 어셈블리1,,56을 제어 하는 것입니다. 그것은 또한 합 microtubules7, axonal 전송8, axonal 직경9에 변화, 싱 경종 극성과 neurodegeneration10의 형성에 기여 한다. 타우는 또한 일부 신호 경로 제어 하는 단백질 비 계 역할을 합니다. 쥐 뇌 연구 제안 그 타우는 신경 및 그것은 주로 축 삭11에서 localizes. 타우 중앙 신경; axonal 개발에 중요 한 역할을 가상 했다 타우 microtubule 중 합 및 신경 발달에 필수적 이므로, 이 가설이 나중에 이었다 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험에 의해 확인. 신경, 외에도 타우 다른 비 신경 세포, 간, 신장 및 근육 세포12,13를 포함 하 여 표현 됩니다. 타우는 표현 또한 인간의 유 방, 전립선, 대 장, 위, 및 췌장암 세포 라인 조직14,15,16,17,18, 19. 타우 또한 포함 시체20꼬인된 tubulofilaments로 포함-몸 근육에서 발견.
타우는 몇 가지 포스트 번역 상 수정을 있습니다. 모든 포스트 번역 상 수정의 인 산화는 가장 일반적입니다. 증가 타우 인 산화 microtubules, 마지막으로 골격을 불안정에 대 한 선호도 감소 합니다. 85 인 산화 사이트 타우 단백질 Alzheimer의 질병이 인간의 뇌 조직에서 분리에 설명 했습니다. 이 사이트의 53% 구성 떠들고, 41% 트레오닌, 유일한 6% 티로신 잔류물21,,2223입니다. 타우 인 산화의 현지화, 기능, 바인딩, 가용성, 및 다른 포스트 번역 상 수정에의 민감성에 영향을 줍니다. 정상 범위 보다도 타우 인 산화 (또는 인산 염 그룹으로 채도가) 알 츠 하이 머 병24의 구조 및 기능적인 특성을 복제 하는 hyperphosphorylation로 알려져 있다. 타우 axonal microtubules의 적절 한 작동 하 고 생리 적 조건 하에서 정상적인 신경 기능을 보장 합니다. 그러나, hyperphosphorylated 타우 microtubule 해체 때문에 신경 손실의 원인이 조직적된 microtubule 바인딩을 유지 하기 위해 실패 합니다. 타우 인 산화의 정상 수준 기능, 적절 한 타우 필요 하지만 타우의 특성 인 산화 수준을 변경 하는 경우 및 경우 hyperphosphorylated25정상적으로 작동 하는 데 실패. Alzheimer의 질병 그리고 다른 나이 관련 된 신경 장애, 타우 hyperphosphorylated 되 고 형성 하는 대응된 나선형 필 라 멘 트 및 neurofibrillary tangles26,27. 따라서, 타우 인 산화 및 microtubule 바인딩 결정 하는 방법 중요 하다.
대 장 암, 암, 노화 관련 된 세 번째는 가장 자주 암과 세 번째 눈에 띄는 죽음을 일으키는 남성, 여성 모두28암 진단 이다. 대 장 암 서방 세계29주요 사망 원인 암 중 하나입니다. 대 장 암과 Alzheimer의 질병 노화와 관련 된 둘 다 사람들이 비슷한 식습관을 즐길 있는 선진국에서 주로 발생 하기 때문에, 두 질병 어떻게든 상관 될 수 있습니다. 또한, 타우 양수와 음수가 타우 암 세포는 화학요법 대리인, 예를 들면, paclitaxel16에 다르게 응답.
Curcumin은 longa 되더라도, 인도 향미료 심 황30의 주요 파생 상품 중 하나입니다. 수세기 동안, 남쪽 아시아 인구는 매일 그들의 규정식에 있는 심 황을 소모 하 고. Curcumin는 대 장 암, Alzheimer의 질병, 당뇨병, 낭 성 섬유 증, 염증 성 장 질환, 관절염, 혈, 동맥 경화 증 및 허 혈 성 심장 질환31, 등 다른 질병을 치료 하는 데 사용 됩니다. 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. 리튬 또한 대 장 암 세포를 죽 일 수 있다 또는39그들의 확산 방지. Alzheimer의 질병40 타우 집계를 감소 하 고 유전자 변형 마우스 모델41,,4243에 관측 된 그것의 hyperphosphorylation를 방지 치료를 위한 리튬을 사용하실 수 있습니다. 44.
이 원고를 목표로: 1) 총 타우 및 치료 세포; 인 타우 식 레벨 측정 2) 측정 전체 타우 인 산화; 인산 가수분해 효소 분석 결과 설명 3) 검사의; microtubule 바인딩 그리고 4) 타우 confocal 현미경 검사 법 대 장 암 세포 라인 curcumin와 LiCl 치료 하 여 지역화. 결과 curcumin와 세포 치료, 대 장 암에 대 한 일 걸 요 좋은 화학요법 에이전트 그리고 LiCl 치료 두 총의 식을 줄일 수 있으며, 대 장 암 세포 라인에 타우 phosphorylated 공개. 이러한 치료의 핵 전 좌를 발생할 수 있습니다. 그러나, 예기치 않게, curcumin microtubules에의 바인딩 개선 실패 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HCT 116 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (EBSS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30024.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LS 015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Coster 3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau 13 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab19030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 708 984 001</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre Centrifuges</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td>MIKRO 200 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1912</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>78246</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubules (MT)</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MT001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C (desiccated)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LB 001-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Model 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay dye reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin (11H10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau (phospho S396) antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab109390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EF0651</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5870</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5871</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 0278</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau-352 human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 9950</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X - 100</td>
			<td>Store at around 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscopy</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells

Microtubule 관련 단백질 타우 주로 축 삭에서 localizes 신경 단백질 이다. 일반적으로 타우 그것은 microtubule 어셈블리 및 안정화에 관여 하기 때문에 정상적인 신경 기능을 위해 필수적 이다.입니다. 뉴런, 게다가 타우 인간 유 방, 전립선, 위, 대 장, 췌 장의 암 거의 비슷한 구조를 보여줍니다 하 고 신경 타우로 유사한 기능을 발휘 하는 있는으로 표현 된다. 타우와의 인 산화의 금액 microtubules, 안정제로 서의 기능을 변경 하 고 다른 신경 퇴행 성 질환, 알 츠 하이 머 병 등에서 쌍을 이루는 나선형 필 라 멘 트의 발전으로 이어질 수 있습니다. 타우와 microtubule 바인딩 특성의 인 산화 상태를 결정 하는 것이 중요 합니다. 또한, 검사의 세포내 지역화 다른 질병에서 중요 하다. 이 원고 내용 표준 프로토콜 타우 인 산화 및 대 장 암 세포 또는 curcumin와 LiCl 치료 없이 microtubules 타우 바인딩을 측정. 이러한 치료는 암 세포 증식 및 개발을 중지 사용할 수 있습니다. 세포내 지역화의 낮은 양의 항 체를 사용 하는 동안 immunohistochemistry 그리고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 검사 합니다. 이 분석 실험 화합물 타우 hyperphosphorylation 또는 microtubule 바인딩에 영향을 주는 심사에 대 한 반복적으로 사용할 수 있습니다. 다른 tauopathies에 대 한 새로운 치료제 사용 또는 관련된 항 암 에이전트 나타낼 수 있다 잠재적으로 이러한 프로토콜을 사용 하 여.

식 총 타우와 인 타우의 curcumin 또는 LiCl (그림 1)의 다른 농도와 세포 치료 후 시험 되었다. Curcumin의 3 개의 다른 농도와 세포의 치료 감소 타우 식 수준; 그러나, 인 타우 식 치료 curcumin의 낮은 농도 따라 증가 하지만 높은 curcumin 농도와 세포 치료 시 감소. 안티-인-타우 (Ser396) 인 타우의 탐지를 위해 사용 되었다. 총 타우와 인 타우 LiCl (<strong class="xfig"...

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Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

인 산화 및 대 장 암 세포에 타우 단백질의 지역화 함께 Microtubule 바인딩 분석 결과

이 원고는 타우 hyperphosphorylation, 타우에 바인딩 microtubules, 및 약물 치료에 따라 세포내의 지역화를 측정을 측정 하기 위한 표준 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 약물 또는 다른 화합물 타우 hyperphosphorylation 또는 microtubule 바인딩 대상 심사에 대 한 반복적으로 사용할 수 있습니다.

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

연구

생화학

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Rab10 인 산화 탐지 LRRK2 활동 인산 염-바인딩 태그와 SDS 페이지를 사용 하 여

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

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작은 GTPase Prenylation와 GTP 바인딩 사용 하 여 막 분류 및 GTPase 연결 된 Immunosorbent 분석 결과의 검색

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Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

제자리에 근접 결 찰 분석 결과 사용 하 여 단백질 Isoforms의 Heterodimerization의 검출

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

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