Name: assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells
Uploaded: 2017-10-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

Denne forskningen ble utført som del av prosjektet med tittelen "Utvikling og industrialisering av høy verdi kosmetisk råvarer fra marine mikroalger", finansiert av departementet av hav og fiskeri, Korea og ble støttet av en intramural stipend (2Z04930) fra KIST Gangneung Institutt for naturlige produkter.

1. forberedelse av reagenser <ol><li>legge 10 µL av (1 mM) phenylmethylsulfonyl fluor løsning, 10 µL (1 x fra 100 x lager) protease hemmer cocktail løsning og 10 µL (1 x fra 100 x lager) av fosfatase hemmer cocktail løsning 1 mL 1 x radioimmunoprecipitation (RIPA) analysebuffer å forberede komplett RIPA lyseringsbuffer.</li>
	<li>Forberede 10 x generelle tubulin buffer (PEM) buffer.
	<ol><li>Add 800 mM (6.0474 g) piperazin-N-N &#39; - bis - 2-ethanesulfonic acid, 10 mM (95.1 mg) etylenglykol-bi...

Dette manuskriptet etablert forskjellige fremgangsmåter for betingelser for å oppdage totale tau og fosforylert tau i tykktarmskreft celler behandlet med curcumin og LiCl. For å vurdere samlet fosforylering status for tau i protein prøver, ble en fosfatase analysen beskrevet. Denne analysen kan brukes til å undersøke statusen fosforylering noen protein.
Denne analysen er basert på prinsippet om at fosforylert protein trekk tregere enn tilstanden ikke-fosforylert. Alkalisk fosfatase og a...

Tau ble opprinnelig identifisert som en varme-stabil microtubule-assosiert protein som var co renset med tubulin1. Tau uttrykkes utelukkende i høyere eukaryoter2,3,4. Hovedfunksjonen til tau er å kontrollere microtubule montering1,5,6. Det bidrar også til av piskehale som henger7, axonal transport8, endringer i axonal diameter9, dannelsen av neuroma polaritet og neurodegeneration10. Tau fungerer også som en protein stillaset å kontrollere noen signalveier. Rotte hjernen studier tyder på at tau Nevron-spesifikke og at det først og fremst regionaliserer i axons11. Tau er avgjørende for microtubule polymerisasjon og neuronal utvikling, var tau hypotesen for å spille en viktig rolle i axonal utvikling i det sentrale nervesystemet; denne hypotesen ble senere bekreftet av eksperimenter i vitro og vivo . I tillegg til neurons, er tau uttrykt i forskjellige ikke-neuronal celler, inkludert lever, nyre og muskel celler12,13. Tau er også uttrykt i menneskelig bryst og prostata, colorectal, mage, bukspyttkjertelkreft cellen linjer og vev14,15,16,17,18, 19. tau er også funnet i inkludering kroppen myositt som vridd tubulofilaments i inkludering organer20.
Tau kan bære flere post-translasjonell modifikasjoner. Av alle post-translasjonell modifikasjoner er fosforylering den vanligste. Økt tau fosforylering reduserer sin affinitet for piskehale som henger, endelig destabiliserende cytoskeleton. Åttifem fosforylering nettsteder har blitt beskrevet i tau protein isolert fra menneskelige Alzheimers sykdom hjernen vev. Disse områdene utgjør 53% serine, 41% threonin, og bare 6% tyrosin rester21,22,23. Tau fosforylering påvirker beliggenheten, funksjon, binding, løselighet og sin mottakelighet for andre post-translasjonell endringer. Også tau fosforylering mer enn vanlig omfanget (eller mettede med fosfat grupper) som kalles hyperphosphorylation som reproduserer strukturelle og funksjonelle egenskaper av Alzheimers24. Tau opprettholder riktig funksjon av axonal piskehale som henger og sikrer normal neuronal fungerer under fysiologiske forhold. Imidlertid mislykkes hyperphosphorylated tau å opprettholde en velorganisert microtubule binding, forårsaker neuronal tap på grunn av microtubule demontering. Normale nivåer av tau fosforylering er nødvendig for riktig tau fungerer, men tau mislykkes å fungere normalt hvis karakteristiske fosforylering nivået endres og det er hyperphosphorylated25. Alzheimers sykdom og noen andre aldersrelaterte nevrodegenerative lidelser, tau blir hyperphosphorylated og danner par spiralformede filamenter og neurofibrillary ledninger26,27. Dermed er metoder for å bestemme tau fosforylering og microtubule binding viktig.
Tykktarmskreft, en aldrende-assosiert kreft, er tredje mest diagnostisert i tredje fremtredende død-forårsaker kreft for både menn og kvinner28. Colorectal cancer er en av de viktigste død som forårsaker kreft i den vestlige verden29. Fordi både kolorektal kreft og Alzheimers sykdom er forbundet med aldring og begge skjer hovedsakelig i de utviklede landene der folk nyte lignende kostvaner, kan de to sykdommene liksom være korrelert. I tillegg reagere tau-positive og tau-negative kreftceller forskjellig på chemotherapeutic agenter, f.eks, paklitaxel16.
Curcumin er en av de viktigste derivater av Curcuma longaindisk krydder gurkemeie30. I århundrer har sørasiatiske bestander fortært gurkemeie i kosten på daglig basis. Curcumin brukes til å behandle ulike sykdommer, inkludert tykktarmskreft, Alzheimers sykdom, diabetes, cystic fibrosis, inflammatorisk tarmsykdom, leddgikt, hyperlipidemi, åreforkalkning og iskemisk hjertesykdom31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. lithium kan også drepe tykktarmskreft celler eller hindre deres spredning39. Litium kan også brukes for behandling av Alzheimers40 som det reduserer tau aggregering og hindrer sin hyperphosphorylation som observert i en transgene mus modell41,42,43, 44.
Dette manuskriptet har som mål å: 1) måle totale tau og phospho-tau uttrykk nivåer i behandlet celler. 2) Beskriv en fosfatase analysen for å måle samlede tau fosforylering; 3) undersøke microtubule-binding av tau; og 4) lokalisere tau av AC confocal mikroskopi i tykktarmskreft cellelinjer behandlet med curcumin eller LiCl. Resultatene viser at cellen behandling med curcumin, som er en angivelig bra chemotherapeutic agent for tykktarmskreft, og behandling med LiCl kan redusere uttrykk for både totale tau og fosforylert tau i tykktarmskreft linjer. Disse behandlinger kan også forårsake kjernefysiske translokasjon av tau. Imidlertid uventet mislykkes curcumin å forbedre binding av tau til piskehale som henger.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HCT 116 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (EBSS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30024.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LS 015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Coster 3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau 13 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab19030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 708 984 001</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre Centrifuges</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td>MIKRO 200 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1912</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>78246</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubules (MT)</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MT001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C (desiccated)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LB 001-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Model 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay dye reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin (11H10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau (phospho S396) antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab109390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EF0651</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5870</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5871</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 0278</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau-352 human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 9950</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X - 100</td>
			<td>Store at around 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscopy</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells

Microtubule-assosiert protein tau er en neuronal protein som regionaliserer hovedsakelig i axons. Generelt er tau viktig for normal neuronal fungerer fordi det er involvert i microtubule montering og stabilisering. Foruten neurons, er tau uttrykt i menneskelig bryst og prostata, mage, colorectal, pancreatic kreft hvor det viser nesten liknende struktur og har lignende funksjoner som neuronal tau. Hvor mye tau og dens fosforylering kan endre dens funksjon som en stabilisator piskehale som henger, og føre til utvikling av sammenkoblede spiralformede filamenter i forskjellige nevrodegenerative sykdommer, som Alzheimers sykdom. Det er viktig å bestemme fosforylering staten tau og egenskapene microtubule-binding. I tillegg er undersøke den intracellulære lokaliseringen av tau viktig i ulike sykdommer. Dette manuskriptet detaljer standard protokoller for å måle tau fosforylering og tau binding til piskehale som henger i tykktarmskreft celler med eller uten curcumin og LiCl behandling. Disse behandlinger kan brukes å stoppe kreft celle spredning og utvikling. Intracellulær lokalisering av tau er undersøkt ved hjelp av immunohistochemistry og AC confocal mikroskopi mens du bruker små mengder av antistoffer. Disse analyser kan brukes gjentatte ganger for screening forbindelser som påvirker tau hyperphosphorylation eller microtubule binding. Romanen therapeutics brukes til ulike tauopathies eller relaterte anticancer agenter kan potensielt være preget bruker disse protokollene.

Uttrykk for total tau og phospho-tau ble undersøkt etter behandling av celler med ulike konsentrasjoner av curcumin eller LiCl (figur 1). Behandling av celler med tre forskjellige konsentrasjonen av curcumin redusert tau uttrykk nivåer; men phospho-tau uttrykk økt på behandling med lav konsentrasjon av curcumin, men redusert ved behandling av celler med høyere curcumin konsentrasjoner. Anti-phospho-tau (Ser396) ble brukt for påvisning av phospho-tau. B?...

Watch this Scientific Journal Video about Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Analysen for fosforylering og Microtubule Binding med lokalisering av Tau Protein i tykktarmskreft celler

Dette manuskriptet beskriver standardprotokoller for å måle tau hyperphosphorylation, måle tau bindende piskehale som henger, og lokalisering av intracellulær tau etter medikamentelle behandlinger. Disse protokollene kan brukes gjentatte ganger for screening narkotika eller andre forbindelser som mål tau hyperphosphorylation eller microtubule-binding.

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptidkonkurranseanalyse for fosforyleringsstedbestemmelse

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering gjenkjenning av LRRK2 aktivitet SDS-side med en fosfat-bindende kode

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Påvisning av små GTPase Prenylation og GTP bindende ved hjelp av membran fraksjoneres og GTPase-koblede Immunosorbent analysen

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Deteksjon av Heterodimerization av Protein isoformene bruker in Situ nærhet Ligation analysen

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analyse av proteinfolding, Transport og nedbrytning i levende celler av radioaktivt puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Humanperifert blod nøytrofil isolasjon for å forhøre Parkinsons tilknyttede LRRK2 Kinase Pathway ved å vurdere Rab10 fosforylering

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende enheter (SUBEs) som verktøy for berikelse, isolasjon, identifisering og karakterisering av SUMO proteom i leverkreft

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

En optimalisert enkeltmolekyls pull-down-analyse for kvantifisering av proteinfosforylering

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...