Name: assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells
Uploaded: 2017-10-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

Esta pesquisa foi realizada como parte do projeto intitulado 'Desenvolvimento e industrialização de matérias primas cosméticas de alto valor de microalgas marinhas', financiado pelo Ministério dos oceanos e das pescas, Coreia e foi apoiado por uma subvenção intramural (2Z04930) KIST Gangneung Instituto de produtos naturais.

1. preparação de reagentes <ol><li>Adicionar 10 µ l da solução de fluoreto de phenylmethylsulfonyl (1 mM), 10 µ l (1 x do estoque de x 100) da solução coquetel de inibidor de protease e 10 µ l (1 x do estoque de x 100) da fosfatase solução de coquetel inibidor para 1 mL de 1 buffer de ensaio (RIPA) x radioimmunoprecipitation para preparar a Lise completa de RIPA.</li>
	<li>Preparar 10 x buffer buffer (PEM) de tubulina geral.
	<ol><li>Adicionar 800 mM (6,0474 g) piperazina-N-N &#39; - bis - ...

Este manuscrito estabeleceu diferentes condições processuais para a detecção de tau total e fosforilada tau em células de cancro colo-rectal, tratados com curcumina e LiCl. Para avaliar o status geral de fosforilação da tau em amostras da proteína, foi descrito um ensaio da fosfatase. Este ensaio potencialmente pode ser usado para examinar o status de fosforilação de proteínas.
Este ensaio é baseado no princípio de que fosforilado proteína movimentos mais lento do que o seu estad...

Tau foi originalmente identificada como uma proteína associada a microtúbulos estável ao calor que estava co purificada com tubulina1. Tau é exclusivamente expressos em eucariontes superiores2,3,4. A principal função do tau é controlar microtubule montagem1,5,6. Também contribui para a polimerização de microtúbulos7, transporte axonal8, alterações no diâmetro axonal9, formação de neuroma polaridade e neurodegeneração10. Tau também atua como um andaime de proteína para controlar algumas vias de sinalização. Estudos do cérebro de rato sugerem que tau é neurônio-específica e que é principalmente localiza em axônios11. Porque tau é essencial para o desenvolvimento neuronal e polimerização de microtúbulos, tau era a hipótese de desempenhar um papel importante no desenvolvimento axonal no sistema nervoso central; mais tarde, esta hipótese foi verificada por experimentos in vitro e in vivo . Além dos neurônios, tau é expressa em células não-neuronais diferentes, incluindo fígado, rim e músculo células12,13. Tau é expressa também em humana mama, próstata, colorretal, gástrica e câncer pancreático célula linhas e tecidos14,15,16,17,18, 19. tau é também encontrado na miosite inclusão-corpo como torcida tubulofilaments em corpos de inclusão20.
Tau pode transportar várias modificações borne-translational. De todas as modificações borne-translational, fosforilação é a mais comum. Fosforilação da tau aumento diminui sua afinidade para os microtúbulos, finalmente, desestabilizando o citoesqueleto. Oitenta e cinco sítios de fosforilação têm sido descritos na proteína tau isolada de tecidos do cérebro humano a doença de Alzheimer. Desses sites, 53% constituem apenas 6% tirosina resíduos21,22,23, 41% de treonina e serina. Fosforilação da Tau afeta sua localização, função, ligação, solubilidade e sua susceptibilidade a outras modificações borne-translational. Também fosforilação de tau a mais do que na medida do normal (ou totalmente saturada com grupos fosfato) é conhecido como hyperphosphorylation que Replica as características estruturais e funcionais da doença de Alzheimer24. Tau mantém o bom funcionamento dos microtúbulos axonal e assegura o funcionamento neuronal normal sob condições fisiológicas. No entanto, hyperphosphorylated tau não consegue manter uma vinculação microtubule bem-organizado, causando perda neuronal por causa de desmontagem do microtubule. Níveis normais de fosforilação da tau são necessários para tau adequado funcionamento, mas tau não funcionar normalmente, se seu nível de fosforilação característico é alterada e se hyperphosphorylated25. Na doença de Alzheimer e algumas outras doenças neurodegenerativas relacionadas com a idade, tau torna-se hyperphosphorylated e forma filamentos helicoidais emparelhados e tangles neurofibrillary26,27. Assim, os métodos para determinar a fosforilação da tau e vinculação de microtúbulos são importantes.
Câncer colorretal, câncer um envelhecimento associada, é que o terceiro mais frequentemente diagnosticado cancro e o terceiro câncer proeminente causadores de morte para homens e mulheres28. Cancro colo-rectal é um dos principais cânceres causadoras de morte no mundo ocidental29. Porque tanto câncer colorretal e doença de Alzheimer estão associados com o envelhecimento e ambos acontecem principalmente em países desenvolvidos, onde as pessoas gostam de hábitos alimentares semelhantes, as duas doenças de alguma forma podem ser correlacionadas. Além disso, as células cancerosas positiva tau e tau respondem de forma diferente de agentes quimioterápicos, por exemplo, paclitaxel16.
A curcumina é um dos principais derivativos de Curcuma longa, açafrão especiaria indiana30. Durante séculos, as populações do Sul da Ásia consumiu cúrcuma em suas dietas em uma base diária. A curcumina é usada para tratar diferentes doenças, incluindo câncer colorretal, doença de Alzheimer, diabetes, fibrose cística, doença inflamatória intestinal, artrite, hiperlipidemia, aterosclerose e cardiopatia isquêmica31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. lítio também pode matar células de câncer colorretal ou impedir a sua proliferação39. Lítio também pode ser usado para tratar a doença de Alzheimer40 que diminui a agregação de tau e impede a sua hyperphosphorylation, como observado em um rato transgênico modelo41,42,43, 44.
Este manuscrito visa: 1) medir o tau total e os níveis de expressão de fosfo-tau em células tratadas; 2) descrevem um ensaio da fosfatase para medir global fosforilação da tau; 3) examinar microtubule-vinculação de tau; e 4) localizar tau pela microscopia confocal em linhas de células de câncer colorretal tratados com curcumina ou LiCl. Os resultados revelam que tratamento com células com curcumina, um supostamente bom agente quimioterapêutico para câncer de cólon, e tratamento com LiCl pode reduzir a expressão de ambos total tau fosforilada tau em linhas de células de câncer colorretal. Estes tratamentos também podem causar a translocação nuclear de tau. No entanto, inesperadamente, a curcumina falha melhorar a ligação do tau de microtúbulos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HCT 116 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (EBSS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30024.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LS 015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Coster 3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau 13 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab19030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 708 984 001</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre Centrifuges</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td>MIKRO 200 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1912</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>78246</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubules (MT)</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MT001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C (desiccated)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LB 001-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Model 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay dye reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin (11H10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau (phospho S396) antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab109390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EF0651</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5870</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5871</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 0278</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau-352 human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 9950</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X - 100</td>
			<td>Store at around 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscopy</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells

O tau de proteína microtubule-associada é uma proteína neuronal que localiza-se principalmente em axônios. Geralmente o tau é essencial para o normal funcionamento neuronal porque está envolvido na estabilização e montagem de microtúbulos. Além de neurônios, tau é expresso em humana mama, próstata, gástrica, colorretal e cânceres pancreáticos, onde mostra a estrutura quase semelhante e exerce funções semelhantes como o tau neuronal. A quantidade de tau e sua fosforilação pode alterar o seu funcionamento como um estabilizador de microtúbulos e levar ao desenvolvimento de filamentos helicoidais emparelhados em doenças neurodegenerativas diferentes, tais como a doença de Alzheimer. Determinar o estado de fosforilação da tau e suas características de microtubule-ligação é importante. Além disso, examinar a localização intracelular do tau é importante em diferentes doenças. Este manuscrito detalhes protocolos padrão para medir a fosforilação da tau e tau vinculação de microtúbulos nas células de cancro colo-rectal com ou sem a curcumina e tratamento LiCl. Esses tratamentos podem ser usados para parar o desenvolvimento e proliferação de células cancerosas. Localização intracelular do tau é examinada com o uso de imuno-histoquímica e microscopia confocal enquanto estiver usando quantidades baixas de anticorpos. Estes ensaios podem ser usados repetidamente para compostos que afetam hyperphosphorylation tau ou vinculação do microtubule de triagem. Novela terapêutica usada para diferentes Tauopatias ou agentes anticancerígenos relacionados potencialmente podem ser caracterizados usando esses protocolos.

Analisou-se a expressão de fosfo-tau e tau total após o tratamento das células com diferentes concentrações de curcumina ou LiCl (Figura 1). Tratamento das células com as três diferentes concentrações de curcumina diminuiu níveis de expressão de tau; no entanto, expressão fosfo-tau aumentou após o tratamento com baixa concentração de curcumina mas diminuiu após tratamento de células com altas concentrações de curcumina. Antifosfo-tau (Ser39...

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Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Ensaio para fosforilação e vinculação de Microtubule juntamente com a localização da proteína Tau em células de cancro colo-rectal

Este manuscrito descreve protocolos padrão para medir a tau hyperphosphorylation, medindo a vinculação de tau de microtúbulos e localização de tau intracelular após tratamentos com drogas. Estes protocolos podem ser usados repetidamente para triagem de drogas ou outros compostos que se destinam a ligação de hyperphosphorylation ou microtubule tau.

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Ensaio de Competição Oligopeptídica para Determinação de Sítio de Fosforilação

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Bioquímica

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Deteção de fosforilação Rab10 pela atividade LRRK2 utilizando SDS-PAGE com um Tag de ligação de fosfato

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Deteção de pequena GTPase Prenilação e GTP ligação usando o fracionamento de membrana e ensaio de imunoabsorção ligada de GTPase

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Deteção de Heterodimerization de isoformas de proteínas usando um ensaio de ligadura de proximidade em Situ

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Microgravimetry dissipativo para estudar a dinâmica da vinculação do fosfolipídeo proteína anexina A2 para Bilayers do Lipid com suporte sólido usando um ressonador de quartzo

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Medição de alta sensibilidade de afinidades de ligação do fator-DNA transcrição por titulação do competidor usando microscopia de fluorescência

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Análise de proteínas, transporte e degradação em células vivas por pulso radioativo Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Isolamento de neutrófilos de sangue periférico humano para interrogar o Caminho Associado lRRK2 Kinase de Parkinson avaliando rab10 fosforilação

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Entidades vinculantes ao SUMO (SUBEs) como ferramentas para enriquecimento, isolamento, identificação e caracterização do Proteome SUMO em Câncer de Fígado

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Um ensaio de recuo de molécula única otimizado para quantificação da fosforilação de proteínas

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...