Name: assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells
Uploaded: 2017-10-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

Это исследование было выполнено как частью проекта под названием «Развитие и индустриализации высокое значение косметического сырья из морских водорослей», финансируемого министерством океанов и рыболовства, Корея и была поддержана интрамуральных Грант (2Z04930) от института Каннын в KIST натуральных продуктов.

1. Подготовка реагентов <ol><li>Добавить 10 мкл (1 мм) phenylmethylsulfonyl фторида раствор, 10 мкл (1 x из 100 x запасов) ингибитор протеазы коктейль решения и 10 мкл (1 x из 100 x запасов) фосфатазы ингибитор коктейль решение по 1 мл 1 x radioimmunoprecipitation проба (RIPA) буфера подготовить полный буфера lysis RIPA.</li>
	<li>Подг...

Эта рукопись учредил различные процедурные условия для обнаружения всего Тау и фосфорилированных Тау в клетках колоректального рака, обработанных с куркумин и LiCl. Чтобы оценить общее состояние фосфорилирование Тау в образцы протеина, фосфатазы пробирного был описан. Этот assay потенциа...

Тау первоначально была определена как тепло stable микротрубочек связанный белок, который был совместной очищенную с тубулин1. Тау исключительно выражается в высших эукариот2,3,4. Основная функция Тау является контроль микротрубочек Ассамблея1,5,6. Он также способствует полимеризации микротрубочек7, аксональное транспорта8, изменения в аксональное диаметр9, формирование Неврома полярности, и нейродегенеративные10. Тау также действует как белка лески для управления некоторые сигнальные пути. Исследования мозга крысы предположить что Тау нейрон конкретной и что он локализуется преимущественно в аксоны11. Потому что Тау имеет важное значение для полимеризации микротрубочек и развития нервной системы, Тау был предположить, чтобы играть важную роль в аксональное развития центральной нервной системы; Эта гипотеза была позднее подтверждена экспериментах in vitro и in vivo . В дополнение к нейронов Тау выражается в различных не нейрональных клеток, включая печень, почки и мышечные клетки12,13. Тау выражается также в груди человека, простаты, толстой кишки, желудка и рака поджелудочной железы клетки линии и тканей14,15,16,17,18, 19. Тау встречается также в миозит включение тело как витой tubulofilaments включения органов20.
Тау могут нести несколько столб-поступательные изменения. Из всех столб-поступательные изменения фосфорилирование является наиболее распространенным. Увеличение Тау фосфорилирование уменьшается его сродство для микротрубочек, наконец дестабилизации цитоскелета. Восемьдесят пять фосфорилирование сайты были описаны в белка Тау, изолированных от тканей мозга человека болезни Альцгеймера. Из этих сайтов 53% составляют Серин, треонин 41% и только 6% тирозин остатков21,22,23. Тау фосфорилирование влияет на его локализации, функции, привязки, растворимость и его восприимчивости к другой столб-поступательные изменения. Также Тау фосфорилирование более чем нормальной степени (или полностью насыщенных с фосфатными группами) известен как hyperphosphorylation, которая реплицирует структурные и функциональные характеристики болезни Альцгеймера24. Тау поддерживает надлежащее функционирование аксональное микротрубочек и обеспечивает нормальное функционирование нейронов в физиологических условиях. Однако hyperphosphorylated Тау не поддерживать привязку хорошо организованной микротрубочек, гибели нейронов вследствие микротрубочек разборки. Нормальные уровни Тау фосфорилирование необходимы для надлежащего функционирования Тау, но Тау не может нормально функционировать, если его характерные фосфорилирование уровень изменяется, и если это hyperphosphorylated25. В болезни Альцгеймера и некоторые другие связанные с возрастом нейродегенеративных расстройств Тау становится hyperphosphorylated и образует парные спиральные нити и нейрофибриллярных клубков26,27. Таким образом важное значение имеют методы определения Тау фосфорилирования и микротрубочек привязки.
Колоректальный рак, старение связанных, является третьим наиболее часто диагноз рака и третий выдающийся причиной смерти для мужчин и женщин28. Колоректальный рак является одной из главной причиной смерти рака в западном мире29. Потому что колоректального рака и болезни Альцгеймера, связанные со старением, и оба происходят главным образом в развитых странах, где люди наслаждаются аналогичные пищевые привычки, двух заболеваний могут быть каким-то образом связаны. Кроме того Тау позитивных и негативных Тау раковые клетки реагируют по-разному химиотерапевтических агентов, например, паклитаксел16.
Куркумин является одним из основных производных Куркума longa, индийские специи куркумы30. На протяжении веков Южной Азии населения потребляли куркумы в их диетпитаниях на ежедневной основе. Куркумин используется для лечения различных заболеваний, включая колоректальный рак, болезнь Альцгеймера, диабет, кистозный фиброз, воспалительные заболевания кишечника, артрит, гиперлипидемия, атеросклероз и ишемическая болезнь сердца31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. лития может также убить колоректальные раковые клетки или предотвращения их распространения39. Лития может также использоваться для лечения болезни Альцгеймера40 , как он уменьшает Тау агрегации и предотвращает его hyperphosphorylation, как отмечено в трансгенные мыши модель41,,4243, 44.
Эта рукопись направлена на: 1) измеряют всего Тау и уровни выражения фосфо Тау в очищенной ячейки; 2) описывают фосфатазы пробирного для измерения общей Тау фосфорилирования; 3) изучить микротрубочек привязки Тау; и 4) локализовать Тау, confocal микроскопии в клеточных линиях колоректального рака лечение куркумин или LiCl. Результаты показывают, что клеток лечение с куркумин, который якобы хорошего химиотерапевтического агента для рака толстой кишки, и лечение с LiCl может уменьшить выражение как общая Тау и фосфорилированных Тау в colorectal рак клеточных линий. Эти процедуры могут также вызвать ядерный транслокации Тау. Однако неожиданно, куркумин не улучшить связывание Тау микротрубочек.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HCT 116 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (EBSS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30024.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LS 015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Coster 3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau 13 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab19030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 708 984 001</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre Centrifuges</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td>MIKRO 200 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1912</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>78246</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubules (MT)</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MT001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C (desiccated)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LB 001-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Model 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay dye reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin (11H10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau (phospho S396) antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab109390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EF0651</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5870</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5871</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 0278</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau-352 human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 9950</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X - 100</td>
			<td>Store at around 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscopy</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells

Микротрубочки связанные белка Тау — нейронов белок, локализуется преимущественно в аксонов. Как правило Тау имеет важное значение для нормального функционирования нейронов, потому что он участвует в Ассамблее микротрубочек и стабилизации. Кроме того, нейроны Тау выражается в груди человека и предстательной железы, желудка, толстой кишки, поджелудочной железы, где он показывает почти аналогичные структуры и оказывает аналогичные функции как нейрональных Тау. Количество Тау и его фосфорилирование может изменить свою функцию как стабилизатор микротрубочек и привести к развитию парных винтовой нитей в различных нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера. Определение состояния фосфорилирование Тау и его характеристики микротрубочек привязки имеет важное значение. Кроме того изучение внутриклеточной локализации Тау имеет важное значение в различных заболеваний. Эта рукопись детали стандартные протоколы для измерения Тау фосфорилирования и Тау связывание микротрубочек в клетках рака прямой кишки с или без куркумин и LiCl лечения. Эти процедуры может использоваться для остановки распространения раковых клеток и развитию. Внутриклеточной локализации Тау проверяется с помощью иммуногистохимии и конфокальная микроскопия при использовании низкого количества антител. Эти анализы могут использоваться многократно для проверки соединений, которые влияют на hyperphosphorylation Тау или привязки микротрубочек. Роман терапии используется для различных tauopathies или потенциально связанные противоопухолевых агентов можно охарактеризовать с помощью этих протоколов.

Выражение всего Тау и фосфо Тау был рассмотрен после лечения клетки с различной концентрации куркумин или LiCl (рис. 1). Лечение клеток с трех различных концентрации куркумин снизились уровни выражения Тау; фосфо Тау выражение увеличилось после лечения с ...

Watch this Scientific Journal Video about Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Assay для фосфорилирования и привязки микротрубочек наряду с локализацией тау белка в клетках рака прямой кишки

Эта рукопись описывает стандартные протоколы для измерения Тау hyperphosphorylation, измерения Тау привязки микротрубочек и локализация внутриклеточных Тау, после медикаментозного лечения. Эти протоколы могут использоваться многократно для скрининга наркотиков или других соединений, которые нацелены Тау hyperphosphorylation или микротрубочек привязки.

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Определение конкуренции на олигопептидах для определения местонахождения фосфорилирования

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Обнаружение Rab10 фосфорилирования LRRK2 деятельностью с помощью SDS-страницы с тегом фосфат привязки

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Обнаружение малых ГТФазы Prenylation и GTP привязки с помощью мембраны фракционирования и ГТФазы-Assay иммуносорбента

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Обнаружение Heterodimerization изоформ белка, используя Assay в Situ близости лигирование

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Диссипативных Microgravimetry для изучения динамики привязки фосфолипидного связывая протеин Annexin A2 в твердой поддержке липидов бислоев с помощью кварцевого резонатора

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Высокая чувствительность измерение транскрипции фактор ДНК привязки родство по конкурентоспособным титрования, с помощью микроскопии флуоресцирования

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Анализ сворачивание белков, транспорта и деградации в живых клетках, радиоактивных пульс Чейз

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Человеческая периферическая кровь Нейтрофилов Изоляция для допроса Паркинсона Связанные LRRK2 Киназы Путь путем оценки Rab10 фосфорилирования

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-обязательные организации (SUBEs) как инструменты для обогащения, изоляции, идентификации и характеристики ПРОтеоме СУМО при раке печени

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Оптимизированный одномолекулярный анализ для количественной оценки фосфорилирования белка

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...