Name: assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells
Uploaded: 2017-10-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

Denna forskning utfördes som en del av projektet med titeln 'Utveckling och industrialisering av högt värde kosmetiska råvaror från Marina mikroalger' finansieras av departement av hav och fiske, Korea och stöddes av en intramural grant (2Z04930) från KIST Gangneung Institutet för naturliga produkter.

1. beredning av reagens <ol><li>Lägg till 10 µL av (1 mM) phenylmethylsulfonyl fluor lösning, 10 µL (1 x 100 x lagervara) proteas hämmare cocktail lösning och 10 µL (1 x 100 x lagervara) fosfatas hämmare cocktail lösning 1 ml 1 x radioimmunoprecipitation (RIPA) analysbuffert att förbereda den komplett RIPA lyseringsbuffert.</li>
	<li>Förbered 10 x allmänna tubulin buffert (PEM) buffert.
	<ol><li>Lägg till 800 mM (6.0474 g) piperazin-N-N &#39; - bis - 2-ethanesulfonic acid, 10 mM (95,1 mg)...

Detta manuskript etablerade olika processuella förutsättningarna för att upptäcka totalt tau och fosforyleras tau i kolorektal cancerceller behandlas med curcumin och LiCl. För att bedöma övergripande phosphorylation status för tau i protein prover, beskrevs ett fosfatas assay. Denna analys kan användas för att undersöka phosphorylation status för något protein.
Denna analys bygger på principen att fosforyleras protein rörelser långsammare än dess icke-fosforyleras tillstånd....

Tau identifierades ursprungligen som ett heat-stable mikrotubulära-associerade protein som var samtidig renat med tubulin1. Tau uttrycks enbart i högre eukaryotes2,3,4. Tau huvudsakliga funktion är att styra mikrotubulära montering1,5,6. Det bidrar också till polymerisation av mikrotubuli7, axonal transport8, förändringar i axonal diameter9, bildandet av neurom polaritet och neurodegeneration10. Tau fungerar också som en protein byggnadsställning att styra vissa signalvägar. Rat hjärnan studier tyder på att tau är neuron-specifika och att det primärt lokaliserar i axoner11. Eftersom tau är viktigt för mikrotubuli polymerisation och neuronal utveckling, antogs tau för att spela en viktig roll i axonal utveckling i det centrala nervsystemet; Denna hypotes var senare verifierade av in vitro- och in-vivo experiment. Förutom nervceller uttrycks tau i olika icke-neuronala celler, inklusive lever, njure och muskel celler12,13. Tau uttrycks också i mänskliga bröstcancer, prostatacancer, kolorektal-, ventrikel, och bukspottskörteln cancer cell linjer och vävnader14,15,16,17,18, 19. tau finns även i inkludering-body myosit som vridna tubulofilaments i organ i inkludering20.
Tau kan bära flera post-translationella modifieringar. Alla post-translationella modifieringar är fosforylering den vanligaste. Ökad tau fosforylering minskar dess affinitet för mikrotubuli, slutligen destabiliserande cytoskelettet. Åttiofem fosforylering platser har beskrivits i tau-protein som isolerats från mänskliga Alzheimers sjukdom hjärnans vävnader. Av dessa webbplatser utgör 53% serine, 41% treonin och bara 6% tyrosin rester21,22,23. Tau fosforylering påverkar dess lokalisering, funktion, bindande, löslighet och dess känslighet för andra post-translationella modifieringar. Även tau fosforylering till mer än den normal omfattningen (eller helt mättade med fosfatgrupper) kallas hyperphosphorylation som replikerar strukturella och funktionella egenskaper hos Alzheimers sjukdom24. Tau upprätthåller fungerande de axonal mikrotubuli och garanterar normal neuronal funktion under fysiologiska betingelser. Men misslyckas hyperphosphorylated tau att upprätthålla en välorganiserad mikrotubulära bindning, orsakar neuronala förlust på grund av mikrotubuli isärtagning. Normala nivåer av tau fosforylering krävs för korrekt tau funktion, men tau misslyckas att fungera normalt om dess karakteristiska fosforylering nivå ändras och om det är hyperphosphorylated25. I Alzheimers sjukdom och vissa andra åldersrelaterade neurodegenerativa sjukdomar, tau blir hyperphosphorylated och bildar Parade spiralformade filament och fibrillnystan26,27. Metoder för att bestämma tau fosforylering och mikrotubuli bindning är alltså viktigt.
Kolorektal cancer, en åldrande-associerade, är tredje vanligaste diagnosen cancer och tredje framträdande död-orsakar cancer för både män och kvinnor28. Kolorektal cancer är en av de viktigaste död som orsakar cancer i västvärlden29. Eftersom både kolorektal cancer och Alzheimers sjukdom är associerad med åldrande och båda sker främst i de utvecklade länderna där människor njuta av liknande matvanor, kan de två sjukdomarna på något sätt vara korrelerade. Dessutom reagerar tau-positiv och tau-negativ cancerceller olika på kemoterapeutika, t.ex., paklitaxel16.
Curcumin är en av de främsta derivat av Curcuma longa, Indisk krydda gurkmeja30. I århundraden har södra asiatiska populationer konsumeras gurkmeja i sin kost på en daglig basis. Curcumin är används för att behandla olika sjukdomar, inklusive kolorektal cancer, Alzheimers sjukdom, diabetes, cystisk fibros, inflammatorisk tarmsjukdom, artrit, hyperlipidemi, åderförkalkning och ischemisk hjärtsjukdom31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. litium kan också döda kolorektal cancerceller eller förhindra deras spridning39. Litium kan också användas för att behandla Alzheimers sjukdom40 som den minskar tau aggregering och motverkar dess hyperphosphorylation som observerats i en transgen mus modell41,42,43, 44.
Detta manuskript syftar till att: 1) mäter totalt tau och phospho-tau uttrycksnivåerna i behandlade celler; (2) Beskriv ett fosfatas-test för att mäta övergripande tau fosforylering; (3) undersöka mikrotubulära-bindningen av tau; och 4) lokalisera tau av konfokalmikroskopi i kolorektal cancer cellinjer behandlas med curcumin eller LiCl. Resultaten visar att cellen behandling med curcumin, som är en förment bra kemoterapeutiska medel för tjocktarmscancer, och behandling med LiCl kan minska uttryck för båda totalt tau och fosforyleras tau i kolorektal cancer cellinjer. Dessa behandlingar kan också orsaka translokationen i cellkärnan Tau. Men oväntat, misslyckas curcumin att förbättra bindningen av tau till mikrotubuli.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HCT 116 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (EBSS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30024.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LS 015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Coster 3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau 13 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab19030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 708 984 001</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre Centrifuges</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td>MIKRO 200 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1912</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>78246</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubules (MT)</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MT001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C (desiccated)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LB 001-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Model 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay dye reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin (11H10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau (phospho S396) antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab109390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EF0651</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5870</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5871</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 0278</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau-352 human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 9950</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X - 100</td>
			<td>Store at around 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscopy</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells

Det mikrotubulära-associerade proteinet tau är ett neuronala protein som lokaliserar mestadels i axoner. Allmänhet är tau viktigt för normal neuronal funktion eftersom det är engagerade i mikrotubuli montering och stabilisering. Förutom nervceller uttrycks tau i mänskliga bröstcancer, prostatacancer, gastric, kolorektal, och pankreas cancer där det visar nästan liknande struktur och utövar liknande funktioner som den neuronala tau. Mängden av tau och dess fosforylering kan ändra dess funktion som en stabilisator av mikrotubuli, och leda till utveckling av Parade spiralformade filament i olika neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom. Det är viktigt att fastställa tillståndet fosforylering av tau och dess mikrotubulära-bindande egenskaper. Dessutom är undersöker den intracellulära lokaliseringen av tau viktigt i olika sjukdomar. Detta manuskript Detaljer standard protokoll för mätning av tau fosforylering och tau bindning till mikrotubuli i kolorektal cancerceller med eller utan curcumin och LiCl behandling. Dessa behandlingar kan användas för att stoppa cancer cell spridning och utveckling. Intracellulära lokalisering av tau undersöks med hjälp av immunohistokemi och konfokalmikroskopi medan du använder låga mängder antikroppar. Dessa analyser kan användas upprepade för screening föreningar som påverkar tau hyperphosphorylation eller mikrotubulära bindande. Romanen therapeutics används för olika tauopathies eller relaterade cytostatika kan potentiellt karakteriseras med hjälp av dessa protokoll.

Uttryck för totalt tau och phospho-tau undersöktes efter behandling av cellerna med olika koncentrationer av curcumin eller LiCl (figur 1). Behandling av celler med de tre olika koncentrationerna av curcumin minskade nivåer av tau uttryck; phospho-tau expression ökade vid behandling med låg koncentration av curcumin men minskade vid behandling av celler med högre curcumin koncentration. Anti-phospho-tau (Ser396) användes för detektion av phospho-tau. ...

Watch this Scientific Journal Video about Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Analys för fosforylering och mikrotubuli bindande tillsammans med lokalisering av Tau-Protein i kolorektal cancerceller

Detta manuskript beskriver standardprotokoll för mätning av tau hyperphosphorylation, mäta tau bindning till mikrotubuli och lokalisering av intracellulära tau efter läkemedelsbehandlingar. Dessa protokoll kan användas upprepade för screening droger eller andra föreningar som riktar tau hyperphosphorylation eller mikrotubulära bindande.

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Oligopeptidkompetitionsanalys för fosforyleringsställningsbestämning

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforylering detektion av LRRK2 aktivitet med SDS-PAGE med en fosfat-bindande tagg

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Upptäckt av små GTPase Prenylation och GTP bindande använder membran fraktionering och GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Påvisande av Heterodimerization av Protein isoformer använder en in Situ närhet Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipativa Microgravimetry att studera bindande dynamiken i den fosfolipid bindande proteinet Annexin A2 till Solid-stödda Lipid lipidmonolager med en kvarts Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hög känslighet mätning av transkription faktorn-DNA bindande samhörighet genom konkurrenskraftiga titrering med fluorescensmikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Analys av proteinveckning, Transport och nedbrytning i levande celler av radioaktiva puls Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Human perifert blod Neutrophil Isolering för förhör av Parkinsons associerade LRRK2 Kinas väg genom att bedöma Rab10 Fosforylering

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindande enheter (SUBEs) som verktyg för berikning, isolering, identifiering och karakterisering av SUMO Proteome i lever cancer

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

En optimerad enmolekylär pull-down-analys för kvantifiering av proteinfosforylering

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...