Name: assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells
Uploaded: 2017-10-10T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

Projenin bir parçası 'Kalkınma ve sanayileşme yüksek değer kozmetik hammadde deniz mikroalg' başlıklı, okyanuslar Bakanlığı ve balıkçılık, Kore tarafından finanse edilen ve intramural grant (2Z04930) tarafından desteklenen bu araştırma gerçekleştirildi Doğal ürünlerin KIST nin Gangneung Enstitüsü '.

1. reaktifler hazırlık <ol><li>Ekle 10 µL (1 mM) phenylmethylsulfonyl florür çözüm, 10 µL (1 x 100 x stoktan) proteaz inhibitörü kokteyl çözüm ve 10 µL (1 x 100 x stoktan) fosfataz inhibitörü kokteyl çözüm 1 x radioimmunoprecipitation tahlil (RIPA) arabelleği tam RIPA lizis arabellek hazırlamak için 1 ml.</li>
	<li>Hazırla 10 x genel tübülin arabellek (PEM) arabellek.
	<ol><li>Ekle 800 mM (6.0474 g) piperazin-N-N &#39; - bis - 2-ethanesulfonic asit, 10 mM (95,1 mg) etilen glik...

Bu el yazması toplam tau algılamak için farklı yordam koşullar kurulmuş ve tau curcumin ve LiCl ile tedavi kolorektal kanser hücrelerinde fosforile. Tau protein örneklerinde genel fosforilasyon durumunu değerlendirmek için fosfataz tahlil tanımlanmıştır. Bu tahlil herhangi bir protein fosforilasyon durumunu incelemek için kullanılabilir.
Bu tahlil protein hamle sigara fosforile durumuna yavaş fosforile ilkesine dayanır. Alkalen fosfataz ve alkalen fosfataz arabellek bu protok...

Tau aslında tübülin1ile birlikte saf bir ısı-kararlı Mikrotubul ilişkili protein olarak tespit edilmiştir. Tau sadece daha yüksek Ökaryotlar2,3,4' te ifade edilir. Tau ana fonksiyonu Mikrotubul derleme1,5,6kontrol etmektir. Ayrıca mikrotübüller7, aksonal transport8, aksonlar çapı9değişimler, nöroma polarite ve ateş10polimerizasyon için katkıda bulunur. Tau da bazı sinyal yolları kontrol etmek için bir protein iskele davranır. Sıçan beyin çalışmalar önermek o tau nöron özel ve akson11' öncelikle yerelleştirir. Tau Mikrotubul polimerizasyon ve nöronal gelişim için gerekli olduğundan, tau merkezi sinir sistemi aksonal gelişiminde önemli bir rol oynamaya onaylanmadığına karar; Bu hipotez sonraki vitro ve in vivo deneyler tarafından doğrulanmadı. Nöronlar yanı sıra, karaciğer, böbrek ve kas hücreleri12,13de dahil olmak üzere farklı nöronal olmayan hücrelerde, tau ifade edilir. Tau da insan meme, prostat, kolorektal, mide ve pankreas kanseri hücre satırları ve dokular14,15,16,17,18, ifade edilir 19. tau da dahil organları20bükülmüş tubulofilaments olarak dahil-vücut miyozit içinde bulundu.
Tau birkaç translasyonel modifikasyonlar taşıyabilir. Tüm translasyonel modifikasyonlar fosforilasyon yaygın olarak kullanılır. Artan tau fosforilasyon mikrotübüller, nihayet sitoiskeleti istikrarsızlaştırıcı için onun ilgi azalır. Seksen beş fosforilasyon siteleri insan Alzheimer hastalığı beyin dokulardan izole tau protein tarif edilmistir. Bu siteleri, serin, % 41 treonin ve sadece % 6 tirozin kalıntıları21,22,%2353 teşkil etmektedir. Tau fosforilasyon onun yerelleştirme, fonksiyon, bağlama, çözünürlük ve diğer translasyonel modifikasyonlar, duyarlılık etkiler. Ayrıca tau fosforilasyon normal ölçüde daha (veya fosfat grupları ile tam doygun) Alzheimer hastalığı24yapısal ve işlevsel özellikleri çoğaltır hyperphosphorylation bilinir. Tau aksonal mikrotübüller düzgün tutar ve normal nöronal fizyolojik koşullar altında çalışmasını sağlar. Ancak, hyperphosphorylated tau Mikrotubul sökme nedeniyle nöronal kaybına neden bir iyi organize edilmiş Mikrotubul bağlama korumak başarısız olur. Tau fosforilasyon normal düzeyde uygun tau işleyişi için gereklidir, ancak tau karakteristik fosforilasyon seviyesine bir değişiklik yapıldığında ve hyperphosphorylated25ise normal işlevine başarısız olur. Alzheimer hastalığı ve bazı diğer yaşa bağlı nörodejeneratif hastalıklar, tau hyperphosphorylated olur ve eşleştirilmiş Helisel filamentler ve neurofibrillary tangles26,27oluşturur. Böylece, tau fosforilasyon ve Mikrotubul bağlama belirlemek için önemli yöntemlerdir.
Kolorektal kanser, bir yaşlanma ilişkili kanser üçüncü en sık kanser ve ölümüne neden olan üçüncü önde gelen kanser hem erkek hem de kadınlar için28tanısı var. Kolorektal kanser Batı dünyasının29ana ölümüne neden olan kanser biridir. Kolorektal kanser ve Alzheimer hastalığı yaşlanma ile ilişkili olan ve her ikisi de nerede insanlar benzer beslenme alışkanlıkları zevk gelişmiş ülkelerde özellikle oldu çünkü iki hastalık bir şekilde ilişkili. Buna ek olarak, tau-pozitif ve negatif tau kanser hücrelerinin farklı yanıt kemoterapötik ajanlar, örneğin, Paklitaksel16için.
Curcumin Curcuma longa, Hint baharat zerdeçal30ana türevleri biridir. Yüzyıllar boyunca, Güney Asya nüfus zerdeçal günlük olarak besinlerinde tüketilen sahip. Curcumin kolorektal kanser, Alzheimer hastalığı, şeker hastalığı, Kistik fibrozis, inflamatuvar barsak hastalığı, artrit, hiperlipidemi, ateroskleroz ve iskemik kalp hastalığı31, de dahil olmak üzere farklı hastalıkları tedavi etmek için kullanılır 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. lityum veya kolorektal kanser hücrelerini öldürmek de onların nükleer silahların yayılmasına karşı39önlemek. Lityum de tau toplama azalır ve onun hyperphosphorylation bir transgenik fare modeli41,42,43gözlemlediği gibi engeller olarak Alzheimer hastalığı40 tedavi etmek için kullanılabilir, 44.
Bu el yazması amaçlamaktadır: 1) ölçü toplam tau ve fosfo-tau ifade seviyelerinde işlem görmüş hücreleri; 2) genel tau fosforilasyon ölçmek için bir fosfataz tahlil tarif; 3) tau Mikrotubul bağlama incelemek; ve 4) kolorektal kanser hücre çizgiler curcumin veya LiCl ile tedavi confocal mikroskobu tarafından tau yerelleştirilmesine. Sonuçları curcumin ile hücre tedavi, hangi kolon kanseri için sözde iyi bir kemoterapötik Ajan ve tedavi LiCl ile her iki toplam tau ifade azaltabilir ve tau kolorektal kanser hücre hatlarında fosforile olduğunu ortaya koyuyor. Bu tedaviler de tau nükleer translocation neden olabilir. Ancak, beklenmedik bir şekilde, curcumin tau mikrotübüller için bağlama geliştirmek başarısız olur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HCT 116 cell</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM (EBSS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30024.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher (Gibco)</td>
			<td>16000044</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicillin-streptomycin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LS 015-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>Coster 3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau 13 antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab19030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10 708 984 001</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlitre Centrifuges</td>
			<td>Hettich Zentrifugen</td>
			<td>MIKRO 200 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paclitaxel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1912</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curcumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Fluka)</td>
			<td>78246</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtubules (MT)</td>
			<td>Cytoskeleton</td>
			<td>MT001</td>
			<td>Store at 4 &#176;C (desiccated)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GTP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>WelGene</td>
			<td>LB 001-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Model 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Optima L-100 XP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PIPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>ChemiDoc XRS+</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein assay dye reagent</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;-tubulin (11H10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAPDH (14C10) Rabbit mAb</td>
			<td>Cell signalling</td>
			<td>2118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Tau (phospho S396) antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab109390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>EF0651</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7626</td>
			<td>Store at room temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5870</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Cell Signalling</td>
			<td>5871</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R 0278</td>
			<td>Storage Temperature 2&#8211;8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tau-352 human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T 9950</td>
			<td>Store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X - 100</td>
			<td>Store at around 25 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>162-0177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>A-11005</td>
			<td>Store at 4 &#176;C in the dark</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscopy</td>
			<td>Leica Microsystem</td>
			<td>Leica TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>75819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay for phosphorylation and microtubule binding along with localization of tau protein in colorectal cancer cells

Mikrotubul ilişkili protein tau çoğunlukla akson yerelleştirir nöronal bir proteindir. Genellikle tau Mikrotubul derleme ve sabitleme yer çünkü normal nöronal işleyişi için gereklidir. Nöronlar yanı sıra, tau insan meme, prostat, mide, kolorektal ve nerede neredeyse benzer yapısını gösterir ve benzer işlevleri nöronal tau giderek artan pankreas kanserleri ile ifade edilir. Tau ve onun fosforilasyon miktarı onun işlevini mikrotübüller sabitleyici değiştirin ve Alzheimer hastalığı gibi farklı nörodejeneratif hastalıklarda eşleştirilmiş Helisel filamentler gelişmesine yol. Tau ve Mikrotubul bağlama özellikleri fosforilasyon durumunu belirlemek önemlidir. Buna ek olarak, tau hücre içi lokalizasyonu inceleyerek farklı hastalıklarda önemlidir. Tau fosforilasyon ve mikrotübüller kolorektal kanser hücreleri veya curcumin ve LiCl tedavi olmadan içinde tau bağlama ölçmek için bu el yazması detayları standart iletişim kuralları. Bu tedaviler kanser hücre çoğalması ve geliştirme durdurmak için kullanılabilir. Hücre içi tau yerelleştirilmesini immünhistokimya ve confocal mikroskobu antikorlar düşük miktarda kullanırken kullanarak incelenir. Bu deneyleri hkr tau hyperphosphorylation veya Mikrotubul bağlama etkileyen bileşikler eleme için kullanılabilir. Roman therapeutics için farklı tauopathies kullanılan veya bu iletişim kurallarını kullanarak ilgili antikanser ajanların potansiyel olarak karakterize edilebilir.

Toplam tau ve fosfo-tau ifadesi curcumin veya LiCl (şekil 1) farklı konsantrasyonları hücrelerle tedavi sonra incelenmiştir. Hücre tedavisi curcumin üç farklı konsantrasyonları ile tau ifade seviyeleri azalma; Ancak, fosfo-tau ifade curcumin düşük konsantrasyon ile tedavi üzerine artmış ama daha yüksek curcumin konsantrasyonları hücrelerle tedavi üzerine düşmüştür. Anti-fosfo-tau (Ser396) fosfo-tau tespiti için kullanıldı. LiCl (<s...

Watch this Scientific Journal Video about Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells at JoVE.com

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Tahlil fosforilasyon ve yerelleştirme kolorektal kanser hücrelerinin Tau proteinin birlikte Mikrotubul bağlama için

Bu el yazması tau hyperphosphorylation, tau bağlama mikrotübüller ve hücre içi tau ilaç tedavileri takip yerelleştirilmesini ölçme ölçmek için standart iletişim kurallarını açıklar. Bu protokoller sürekli uyuşturucu ya da tau hyperphosphorylation veya Mikrotubul bağlama hedef diğer bileşikler eleme için kullanılabilir.

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Fosforilasyon Saha Tespiti İçin Oligopeptide Rekabet Testi

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Rab10 Phosphorylation Detection by LRRK2 Activity Using SDS-PAGE with a Phosphate-binding Tag

Rab10 fosforilasyon algılama SDS-sayfa bir fosfat bağlayıcı etiketi ile kullanarak LRRK2 etkinliğini tarafından

Mutations in leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) have been shown to be linked with familial Parkinson&#39;s disease (FPD). Since abnormal activation of ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Küçük GTPazlar prenilasyon ve bağlayıcı kullanarak membran ayırma ve GTPazlar bağlı Immunosorbent Assay GTP tespiti

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Heterodimerization in Situ yakınlık ligasyonu tahlil kullanarak Protein izoformlarının tespiti

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

A2 bir kuvars rezonatör kullanarak katı destekli Lipid Bilayers için Annexin Protein bağlayıcı fosfolipid bağlama dinamikleri çalışmaya dissipative Microgravimetry

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı Affinities floresans mikroskobu kullanarak rekabet titrasyon tarafından yüksek hassasiyet ölçümü

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Protein katlanması, taşıma ve canlı hücreler radyoaktif darbe Chase tarafından bozulması Analizi

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Rab10 Fosforilasyon Değerlendirilmesi tarafından Parkinson İlişkili LRRK2 Kinas yolu Sorgulama için İnsan Periferik Kan Nötrofil İzolasyon

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

Karaciğer Kanserinde SUMO Proteomunun Zenginleştirilmesi, İzolasyon, Tanımlama ve Karakterizasyonu Için Araçlar Olarak SUMO Bağlayıcı Varlıklar (SUBEs)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...

An Optimized Single-Molecule Pull-Down Assay for Quantification of Protein Phosphorylation

Protein Fosforilasyonunun Miktarının Belirlenmesi için Optimize Edilmiş Tek Moleküllü Bir Pull-Down Testi

Phosphorylation is a necessary posttranslational modification that regulates protein function and directs cell signaling outcomes. Current methods to ...