Name: peptide and protein quantification using automated immuno-maldi (imaldi)
Uploaded: 2017-08-18T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI at JoVE.com

Ringraziamo il sostegno finanziario dal Genome Canada e Colombia britannica del genoma per operazioni (204PRO) e lo sviluppo della tecnologia (214PRO) attraverso la rete di innovazioni genoma (GIN). Ringraziamo la piattaforma di Drug Discovery presso l'Istituto di ricerca del McGill University Health Center per l'utilizzo dello strumento MALDI-TOF per le riprese. H.L. è grato per il sostegno da una borsa di studio post-dottorato dal National Science and Engineering Research Consiglio del Canada (NSERC). C.H.B è grato per il sostegno da Leading Edge Endowment Fund (LEEF). C.H.B. è grato per il sostegno della presidenza di McGill Segal in oncologia molecolare presso la McGill University (Montreal, Quebec, Canada). M.X.C. e C.H.B. sono grato per il sostegno del Warren Y. Soper Charitable Trust e la Fondazione di famiglia di Alvin Segal per l'ospedale generale ebreo (Montreal, Quebec, Canada).

gli importi dei reagenti descritti di seguito si basano sulla misurazione di 20 campioni di plasma paziente. Il protocollo presentato di seguito segue le linee guida dell'Università di Victoria &#39; Comitato etico ricerca umana di s.
 1. generazione di Ang I nel Plasma umano <ol><li>scongelare i campioni di plasma (&#8805; 200 µ l) in una stanza temperatura dell'acqua del bagno per 5 min e poi mettere i campioni su ghiaccio fino a quando completamente sciolto.</li>
	<li>Trasferire 200 µ...

<ol>
	<li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+proteomics.">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li><li>Nicol, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+an+Immunoaffinity-Mass+Spectrometry-based+Approach+for+the+Quantification+of+Protein+Biomarkers+from+Serum+Samples+of+Lung+Cancer+Patients.">Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients.</a> Mol. &amp; Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).</li><li>Webster, J., Oxley, D., Zanders, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols. , 227-240 (2012).</li><li>Yergey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=De+novo+sequencing+of+peptides+using+MALDI/TOF-TOF.">De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).</li><li>Anderson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+decades+searching+for+meaning+in+the+proteome.">Six decades searching for meaning in the proteome.</a> J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).</li><li>Landegren, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Opportunities+for+Sensitive+Plasma+Proteome+Analysis.">Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).</li><li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoaffinity+Enrichment+and+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Protein+Methylation.">Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation.</a> Mol. &amp; Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li><li>Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enzyme-linked+immuno-mass+spectrometric+assay+with+the+substrate+adenosine+monophosphate.">An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).</li><li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocapture+strategies+in+translational+proteomics.">Immunocapture strategies in translational proteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).</li><li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Affinity+Capture+and+On-Tip+Digestion+to+Accurately+Quantitate+in+Vivo+Deamidation+of+Therapeutic+Antibodies.">Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies.</a> Anal. Chem. , (2016).</li><li>Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+precision+quantification+of+human+plasma+proteins+using+the+automated+SISCAPA+Immuno-MS+workflow.">High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow.</a> N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).</li><li>Razavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+SISCAPA+Quantitation+of+Peptides+from+Human+Plasma+Digests+by+Ultrafast,+Liquid+Chromatography-Free+Mass+Spectrometry.">High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry.</a> J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).</li><li>Anderson, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SISCAPA+Peptide+Enrichment+on+Magnetic+Beads+Using+an+In-line+Bead+Trap+Device.">SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device.</a> Mol. &amp; Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).</li><li>Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass-spectrometry-based+clinical+proteomics+-+a+review+and+prospective.">Mass-spectrometry-based clinical proteomics - a review and prospective.</a> The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).</li><li>Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+Development+of+an+Immuno+MALDI+(iMALDI)+Mass+Spectrometry+Assay+for+the+Diagnosis+of+Hypertension.">Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).</li><li>Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duplexed+iMALDI+for+the+detection+of+angiotensin+I+and+angiotensin+II.">Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II.</a> Methods. 56 (2), 213-222 (2012).</li><li>Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+an+immuno-MALDI+(iMALDI)+assay+for+angiotensin+I+and+the+diagnosis+of+secondary+hypertension.">Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension.</a> Clin. Proteomics. 10 (1), 20 (2013).</li><li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+immuno+tandem+mass+spectrometry+(iMALDI)+assay+for+EGFR+diagnosis.">Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis.</a> Proteomics Clin Appl. 1, (2007).</li><li>Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Immunoaffinity+Tandem+Mass+Spectrometry+(iMALDI)+assay+for+Detection+of+Francisella+tularensis.">An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis.</a> Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).</li><li>Popp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+assay+for+the+clinical+measurement+of+plasma+renin+activity+by+immuno-MALDI+(iMALDI).">An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI).</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).</li><li>Schoenherr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+screening+of+monoclonal+antibodies+for+SISCAPA+assays+using+a+magnetic+bead+processor+and+liquid+chromatography-selected+reaction+monitoring-mass+spectrometry.">Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry.</a> J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).</li><li>Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+quantitation+and+identification+of+peptides+and+proteins.">Methods of quantitation and identification of peptides and proteins.</a> US patent. , (2010).</li><li>Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+quantitation+and+identification+of+peptides+and+proteins.">Methods of quantitation and identification of peptides and proteins.</a> Canadian patent CA. , (2011).</li><li>Wei&#223;, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catch+and+measure-mass+spectrometry-based+immunoassays+in+biomarker+research.">Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).</li><li>Nelson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibody+fragments:+Hope+and+hype.">Antibody fragments: Hope and hype.</a> mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).</li><li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+evaluation+of+an+aptamer+for+use+as+an+affinity+reagent+with+MS:+PCSK9+as+an+example+protein.">An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein.</a> Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).</li></ol>

Rispetto alla quantificazione di proteine convenzionali basati su MS, iMALDI utilizza anticorpi per arricchire gli analiti e purificarle da campioni complessi, rendendo quindi possibile quantificare le proteine o peptidi a basse concentrazioni. Un passo fondamentale nel protocollo iMALDI è l'immuno-arricchimento dei peptidi destinazione. Per questo scopo, è necessario selezionare anticorpi con alta specificità e affinità. In SISCAPA, è stato segnalato che affinità dell'anticorpo a 10-9 M o meglio sarebbe...

Spettrometria di massa è diventato uno strumento indispensabile in proteomica quantitativa. Spettrometria di massa in grado di determinare le masse delle proteine bersaglio o peptidi, quindi i segnali ottenuti analita possono essere altamente specifici rispetto ai test immunologici. Due metodi di ionizzazione electrospray e MALDI, sono più comunemente utilizzati per la rilevazione di proteine e peptidi1,2,3,4. Una sfida importante nella quantificazione della proteina basate su MS si trova nella rilevazione di bassa-abbondanza di proteine in campioni complessi alle concentrazioni ng/mL o pg/mL in presenza di alta-abbondanza di proteine, e molti candidati proteine biomarcatori trovati nel plasma umano sono all'interno di questa gamma5. Questo problema è causato in gran parte dall'intrinsecamente ampio range dinamico e dalla complessità del proteoma umano6.
Per superare queste difficoltà di rilevazione, sono stati sviluppati metodi immuno-MS per arricchire il bersaglio proteine o peptidi da soluzioni campione su una superficie solida, seguita da eluizione degli analiti e MS misura7,8 , 9 , 10. con immuno-arricchimento, gli analiti sono purificati da campioni complessi e pertanto sono ridotti al minimo gli effetti di ioni-soppressione da altre molecole. Tra i vari supporti solidi, biglie magnetiche attualmente sono più ampiamente usati come hanno i vantaggi della capacità di legame dell'anticorpo alta e maneggevolezza. Biglie magnetiche con diverse funzionalizzazioni e dimensioni sono stati sviluppati e commercializzati per esperimenti di immunoprecipitazione. Fin qui, immuno-arricchimento su perline è stato interfacciato con MALDI-MS e ionizzazione electrospray (ESI) per la misurazione della proteina e del peptide. Isotopo stabile standard e la cattura di tecnologia di anticorpi anti-peptide (SISCAPA), proteine nei campioni sono digeriti, seguita da incubazione con anticorpo-rivestite di perline per immuno-arricchimento. In SISCAPA "classica", i peptidi proteotypic catturati sono eluiti dalle perline e misurati da liquido cromatografia-ESI-MS (LC-MS), o infusione diretta ESI multiplo reazione monitoraggio-MS (MRM-ESI-MS)11,12. Immuno-arricchimento migliorata la sensibilità del dosaggio MRM di 3-4 ordini di grandezza, raggiungendo la fascia bassa ng/mL13.
Rispetto a MS di electrospray, MALDI-MS è più veloce e non comporta la pulizia e il riequilibrio delle colonne LC così non ci sono problemi riporto e contaminazione, rendendolo più adatto per studi di alto-rendimento14. Immuno-MALDI tecnologia è stata sviluppata nel nostro laboratorio di combinare immuno-arricchimento con MALDI-MS per quantificazione sensibile e specifica di peptidi e proteine (basate sulla quantificazione dei peptidi proteotypic)15,16 ,17. Dopo immuno-arricchimento, le perle sono depositate su un piatto di destinazione MALDI, la soluzione di matrice viene aggiunta di perline e il piatto è pronto per l'analisi di un MALDI-TOF-MS dopo l'essiccazione. Eluizione dei peptidi dalle perline non viene eseguita come un passaggio separato, ma associato a affinità analiti sono eluiti dalla soluzione MALDI matrice quando viene aggiunto ai punti tallone, quindi semplificare la preparazione del campione e minimizzazione della perdita di campione. La tecnologia iMALDI è stata applicata in una varietà di applicazioni18,19e recentemente è stata automatizzata e utilizzata per la misurazione dell'angiotensina I (Ang ho) per la determinazione della renina del plasma attività (PRA)20. Questo protocollo sarà dimostrare la procedura utilizzata per eseguire un test automatizzato iMALDI. Prendendo il test PRA come esempio, Inter-giorno CVs di meno del 10% sono stati raggiunti grazie all'automazione, con la capacità di misurare 744 campioni al giorno20.
Il dosaggio PRA iMALDI ha dimostrato in questo manoscritto non richiede la digestione di proteine, come la molecola bersaglio (Ang ho) è un peptide con un peso molecolare di 1295.7 Da. In altri saggi cui digestione delle proteine è necessaria e un peptide è utilizzato come surrogato per la proteina intatta, il peptide selezionato per iMALDI deve essere univoco e specifico per la proteina dell'obiettivo, con una massa oltre 800 Da così che esso può essere facilmente distinto dal c hemical rumore dalla soluzione matrice MALDI. Gli anticorpi anti-peptide sono necessari per l'immuno-arricchimento dei peptidi. Il protocollo per un dosaggio di iMALDI PRA di misura è costituito da quattro fasi: 1) generazione di Ang I nel plasma umano; 2) immuno-arricchimento di Ang che usando le perle di anticorpo-rivestite; 3) trasferimento di perline a una piastra MALDI e aggiungendo soluzione matrix; e 4) acquisizione del segnale con una di analisi dati e MALDI-TOF-MS20.

<table width="892">
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Healthy control human plasma</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Bioreclamation</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">HMPLEDTA2</td>
			<td class="xl66" style="width:242pt" width="323"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Ammonium bicarbonate</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl69">09830</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Ammonium citrate dibasic</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">09833</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">CHAPS (&#62;=98%)</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">C9426</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Albumin from chicken egg white (&#62;98%)</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">A5503</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">EDS</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">70990</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Phosphate buffered saline</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">P4417</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">78830</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Trifluoroacetic acid</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">85172</td>
			<td class="xl66">LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">acetonitrile</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Fluka</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">34967</td>
			<td class="xl66">LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">water</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Fluka</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">39253</td>
			<td class="xl66">LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">acetic acid</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Fluka</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">320099</td>
			<td class="xl66">LC-MS grade</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Roche Diagnostics</td>
			<td class="xl71">3118169001</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Dynabeads Protein G magnetic beads</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">10003D</td>
			<td class="xl66">2.8 &#956;m, 30 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">anti-Ang I goat polyclonal antibody</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">sc-7419</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="84" style="height:63.0pt">
			<td class="xl63" height="84" style="width:204pt;height:63.0pt" width="272">Nat and SIS Ang I</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Automated liquid handling system</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Agilent</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">16050-102</td>
			<td class="xl66">Agilent Bravo robotic workstation</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Magnet</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">12321D</td>
			<td class="xl66">Invitrogen DynaMag-2 magnet</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Tube rotator</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Theromo Scientific</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">400110Q</td>
			<td class="xl66">Labquake Tube Rotator</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Magnet</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">12027</td>
			<td class="xl66">DynaMag-96 side skirted magnet</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">Magnet</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">VP Scientific</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119">771RM-1</td>
			<td class="xl66">used to pull the beads to the bottom of the well</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl63" height="21" style="width:204pt;height:15.75pt" width="272">MALDI-TOF</td>
			<td class="xl63" style="width:134pt" width="178">Bruker</td>
			<td class="xl68" style="width:89pt" width="119"></td>
			<td class="xl66">Bruker Microflex LRF instrument</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

peptide and protein quantification using automated immuno-maldi (imaldi)

Spettrometria di massa (MS) è una delle tecnologie più comunemente utilizzate per la quantificazione di proteine in campioni complessi, con eccellente specificità come risultato la rilevazione diretta del rapporto massa / carica di ogni molecola target. Tuttavia, proteomica basata su MS-, come la maggior parte delle altre tecniche analitiche, ha una polarizzazione verso analiti alta-abbondanza di misura, quindi è difficile da raggiungere limiti di rilevazione di bassa ng/mL o pg/mL in campioni complessi e questo è l'intervallo di concentrazione per molti malattia-relative proteine in biofluidi quali plasma umano. Per aiutare nella rilevazione di analiti di basso-abbondanza, immuno-arricchimento è stato integrato il saggio a concentrarsi e purificare l'analita prima misurazione MS, migliorando significativamente la sensibilità del test. In questo lavoro, la tecnologia di immuno - Assisted Laser Desorption/Ionization (iMALDI) è presentato per la quantificazione delle proteine e dei peptidi in biofluidi, basato su immuno-arricchimento su perline, seguito dalla misura di MALDI-MS senza previa eluizione. Gli anticorpi anti-peptide sono funzionalizzati su biglie magnetiche e incubati con campioni. Dopo il lavaggio, le perle vengono trasferite direttamente su una lastra di destinazione MALDI e i segnali sono stati misurati da un MALDI-tempo di volo (MALDI-TOF) strumento dopo la soluzione di matrice è stata applicata ai talloni. La procedura di preparazione del campione è semplificata rispetto ad altri saggi immuno-MS, e la misurazione di MALDI è veloce. La preparazione del campione intero è automatizzata con un liquido sistema, manipolazione con riproducibilità del migliorato e un throughput più elevato. In questo articolo, l'analisi di iMALDI è usata per determinare l'angiotensina peptide ho (Ang ho) concentrazione nel plasma, che è usato clinicamente come lettura di attività della renina plasmatica per lo screening di aldosteronismo primario (PA).

Una procedura automatizzata iMALDI per la misurazione Ang mi è mostrato nella Figura 1. Peptidi di destinazione (peptidi endogeni o peptidi da proteine digerite) sono arricchite il anti-peptide biglie magnetiche, e quindi le perle vengono trasferite ad una piastra di destinazione per la misura di MALDI. L'intera procedura è semplificata rispetto ad altre tecnologie di immuno-MS che richiedono ulteriori peptide eluizione passaggi. Automazione del dosaggio iM...

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Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

Un protocollo per la quantificazione della proteina in fluidi biologici complessi utilizzando la tecnologia automatizzata immuno-MALDI (iMALDI) è presentato.

Peptidi e proteine quantificazione utilizzando Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

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