Name: improving the application of high molecular weight biotinylated dextran amine for thalamocortical projection tracing in the rat
Uploaded: 2018-04-12T12:30:00
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Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Projekt Code Nr. 81373557, Nr. 81403327) finanziert.

Diese Studie wurde von der Ethikkommission an der China Academy of chinesische Medical Sciences (Referenznummer 20160014) genehmigt. Alle Verfahren wurden im Einklang mit den nationalen Instituten der Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren (nationale Akademie-Presse, Washington, D.C., 1996) durchgeführt. Vier Erwachsene männlichen Ratten (Gewicht 250-280 g) wurden in dieser Studie verwendet. Alle Tiere waren untergebracht in einem 12 h Hell/Dunkel-Zyklus mit kontrollierter Temperatur und Luftfeucht...

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	<li>Veenman, C. L., Reiner, A., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylated+dextran+amine+as+an+anterograde+tracer+for+single-+and+double-labeling+studies.">Biotinylated dextran amine as an anterograde tracer for single- and double-labeling studies.</a> J Neurosci Methods. 41, 239-254 (1992).</li><li>Reiner, A., Veenman, C. L., Medina, L., Jiao, Y., Del Mar, N., Honig, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway+tracing+using+biotinylated+dextran+amines.">Pathway tracing using biotinylated dextran amines.</a> J Neurosci Methods. 103, 23-37 (2000).</li><li>Ling, C., Hendrickson, M. L., Kalil, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+detailed+structure+of+cortical+and+thalamic+neurons+in+the+adult+rat+brain+with+refined+biotinylated+dextran+amine+labeling.">Resolving the detailed structure of cortical and thalamic neurons in the adult rat brain with refined biotinylated dextran amine labeling.</a> PLoS One. 7, e45886 (2012).</li><li>Zhang, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterograde+and+retrograde+tracing+with+high+molecular+weight+biotinylated+dextran+amine+through+thalamocortical+and+corticothalamic+pathways.">Anterograde and retrograde tracing with high molecular weight biotinylated dextran amine through thalamocortical and corticothalamic pathways.</a> Microsc Res Tech. 80, 260-266 (2017).</li><li>Han, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylated+dextran+amine+anterograde+tracing+of+the+canine+corticospinal+tract.">Biotinylated dextran amine anterograde tracing of the canine corticospinal tract.</a> Neural Regen Res. 7, 805-809 (2012).</li><li>Armstrong-James, M., Callahan, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamo-cortical+processing+of+vibrissal+information+in+the+rat.+II.+spatiotemporal+convergence+in+the+thalamic+ventroposterior+medial+nucleus+(VPm)+and+its+relevance+to+generation+of+receptive+fields+of+S1+cortical+&amp;#34;barrel&amp;#34;+neurones.">Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. II. spatiotemporal convergence in the thalamic ventroposterior medial nucleus (VPm) and its relevance to generation of receptive fields of S1 cortical &amp;#34;barrel&amp;#34; neurones.</a> J Comp Neurol. 303, 211-224 (1991).</li><li>Armstrong-James, M., Callahan, C. A., Friedman, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamo-cortical+processing+of+vibrissal+information+in+the+rat.+I.+Intracortical+origins+of+surround+but+not+centre-receptive+fields+of+layer+IV+neurones+in+the+rat+S1+barrel+field+cortex.">Thalamo-cortical processing of vibrissal information in the rat. I. Intracortical origins of surround but not centre-receptive fields of layer IV neurones in the rat S1 barrel field cortex.</a> J Comp Neurol. 303, 193-210 (1991).</li><li>Agmon, A., Yang, L. T., Jones, E. G., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topological+precision+in+the+thalamic+projection+to+neonatal+mouse+barrel+cortex.">Topological precision in the thalamic projection to neonatal mouse barrel cortex.</a> J Neurosci. 15, 549-561 (1995).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (1998).</li><li>Davidoff, M., Schulze, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standard+avidin-biotin-peroxidase+complex+(ABC)+staining+combination+of+the+peroxidase+anti-peroxidase+(PAP)-and+avidin-biotin-peroxidase+complex+(ABC)-techniques:+an+amplification+alternative+in+immunocytochemical+staining.">Standard avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) staining combination of the peroxidase anti-peroxidase (PAP)-and avidin-biotin-peroxidase complex (ABC)-techniques: an amplification alternative in immunocytochemical staining.</a> Histochemistry. 93, 531-536 (1990).</li><li>Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+axonal+diffusion+of+3000+molecular+weight+dextran+amines.">Fast axonal diffusion of 3000 molecular weight dextran amines.</a> J Neurosci Methods. 50, 95-103 (1993).</li><li>Kaneko, T., Saeki, K., Lee, T., Mizuno, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+retrograde+axonal+transport+and+subsequent+visualization+of+tetramethylrhodamine+(TMR)+-dextran+amine+by+means+of+an+acidic+injection+vehicle+and+antibodies+against+TMR.">Improved retrograde axonal transport and subsequent visualization of tetramethylrhodamine (TMR) -dextran amine by means of an acidic injection vehicle and antibodies against TMR.</a> J Neurosci Methods. 65, 157-165 (1996).</li><li>Medina, L., Reiner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efferent+projections+of+the+dorsal+and+ventral+pallidal+parts+of+the+pigeon+basal+ganglia,+studied+with+biotinylated+dextran+amine.">The efferent projections of the dorsal and ventral pallidal parts of the pigeon basal ganglia, studied with biotinylated dextran amine.</a> Neuroscience. 81, 773-802 (1997).</li><li>DE Venecia, R. K., Smelser, C. B., McMullen, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parvalbumin+is+expressed+in+a+reciprocal+circuit+linking+the+medial+geniculate+body+and+auditory+neocortex+in+the+rabbit.">Parvalbumin is expressed in a reciprocal circuit linking the medial geniculate body and auditory neocortex in the rabbit.</a> J Comp Neurol. 400, 349-362 (1998).</li><li>Ojima, H., Takayanagi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+two+anterograde+axon+tracers+to+label+distinct+cortical+neuronal+populations+located+in+close+proximity.">Use of two anterograde axon tracers to label distinct cortical neuronal populations located in close proximity.</a> J Neurosci Methods. 104, 177-182 (2001).</li><li>Kobbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+concepts+in+neuroanatomical+tracing.">Current concepts in neuroanatomical tracing.</a> Prog Neurobiol. 62, 327-351 (2000).</li><li>Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+techniques+for+tracing+pathways+in+the+central+nervous+system+of+developing+and+adult+mammals.">Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals.</a> Brain Res Bull. 51, 11-28 (2000).</li><li>Liao, C. C., Reed, J. L., Kaas, J. H., Qi, H. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracortical+connections+are+altered+after+long-standing+deprivation+of+dorsal+column+inputs+in+the+hand+region+of+area+3b+in+squirrel+monkeys.">Intracortical connections are altered after long-standing deprivation of dorsal column inputs in the hand region of area 3b in squirrel monkeys.</a> J Comp Neurol. 524, 1494-1526 (2016).</li></ol>

Auswahl einer richtigen Tracers ist ein wichtiger Schritt für eine erfolgreiche neuronale Ablaufverfolgung Experiment. In der Familie der BDA, hochmolekularen BDA (10.000 Molekulargewicht) wurde empfohlen, bevorzugt durch die Anterograde neuronalen Signalweg im Gegensatz zu niedermolekularen BDA (3.000 Molekulargewicht)2,3 transportiert werden , 11 , 12 , 13....

Hochmolekularen BDA (10.000 Molekulargewicht), eine hochempfindliche Tracer für tracing Nervenbahnen in das Zentralnervensystem für über 20 Jahre1verwendet worden. Obwohl die Verwendung des BDA eine gemeinsame neuronale Trakt tracing Technik, kann die Qualität der BDA Kennzeichnung bei Tieren durch verschiedene Faktoren1,2,3beeinflusst werden. Unsere aktuelle Studie darauf hingewiesen, dass die optimale Struktur der BDA Beschriftung ist nicht nur eine richtige nach der Injektion Überlebenszeit zugeordnet, sondern auch mit der Färbung Methode4 korreliert. Bis jetzt, konventionelle Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex (ABC), Streptavidin-Fluorescein erfolgt und Streptavidin-AF594 dienten Färbung Methoden zur Aufdeckung der BDA Kennzeichnung in früheren Studien2,3, 4,5. Im Vergleich dazu kann fluoreszierende Färbung für BDA einfach durchgeführt werden.
Um die Anwendung der hochmolekularen BDA zu verlängern, wurde in der vorliegenden Studie eine raffinierte Protokoll eingeführt. Im Anschluss an die Injektion von BDA in der VPM des Thalamus im rattengehirn war BDA Kennzeichnung, offenbart durch die reguläre Methode der standard ABC Färbung sowie durch doppelte fluoreszierende Färbung, die für die Beobachtung der Korrelation der BDA Kennzeichnung durchgeführt wurde und einfach neuralen Elemente oder Interneuronen im kortikalen Ziel mit Streptavidin-AF594 und fluoreszierende Nissl Histochemie oder PV-Immundiagnostik, beziehungsweise. Durch die gegenseitige Nervenbahnen zwischen VPM und die primären somatosensorischen Cortex (S1)6,7,8konzentrierten wir uns unsere Beobachtung auf BDA Kennzeichnung in die Thalamocortical projiziert Axone und corticothalamic projizierte Zelle Somas in der S1. Durch diesen Prozess voraussichtlich nicht nur ein detailliertes Protokoll für den Erhalt der hohen Qualität der neuronalen Etikettieren mit hohem Molekulargewicht BDA, sondern auch eine raffinierte Protokoll über die Kombination von fluoreszierenden BDA Kennzeichnung und andere fluoreszierende neuronale Marker mit Histochemie oder Immunchemie. Dieser Ansatz ist vorzuziehen, den lokalen neuronale Schaltkreise und ihre chemischen Eigenschaften unter einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskopie zu studieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biotinylated dextran amine (BDA)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D1956</td>
			<td>10,000 molecular weight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin-Alexa Fluor 594</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S32356</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500/525 green fluorescent Nissl stain</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>N21480</td>
			<td>Protect from light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain stereotaxis instrument</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SR-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Freezing microtome</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>Microm International GmbH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal imaging</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>FV1200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Drill</td>
			<td>Saeyang Microtech</td>
			<td>Marathon-N7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>Institute of Laboratory Animal Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences</td>
			<td>SCKX (JUN) 2012-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectastain ABC Kit</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>superfrost plus microscope slides</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>#4951PLUS-001</td>
			<td>25x75x1mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop and Illustration</td>
			<td>Adobe</td>
			<td>CS5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improving the application of high molecular weight biotinylated dextran amine for thalamocortical projection tracing in the rat

Hochmolekularen biotinylierte Dextran Amin (BDA) hat seit vielen Jahrzehnten als hochsensible neuroanatomischen Tracer verwendet worden. Da die Qualität der Beschriftung durch verschiedene Faktoren, die hier betroffen war bieten wir eine raffinierte Protokoll für die Anwendung des hohen Molekulargewichts BDA für optimale neuronale Kennzeichnung in das zentrale Nervensystem zu studieren. Nach Stereotaktische Injektion von BDA in den ventralen Posteromedial Kern (VPM) des Thalamus bei der Ratte durch eine zarte Glaspipette war BDA mit fluoreszierenden Streptavidin-Alexa (AF) 594 befleckt und counterstained mit fluoreszierenden Nissl Fleck AF500/525. Auf dem Hintergrund der grünen Nissl Färbung die roten BDA Kennzeichnung, einschließlich der neuronalen Zellkörpern und axonalen Terminals, deutlicher im somatosensorischen Cortex zeigte. Darüber hinaus verdoppelt fluoreszierende Färbung für BDA und die Kalzium-bindenden Proteins Parvalbumin (PV) wurde durchgeführt, um die Korrelation von BDA Kennzeichnung und PV-positiven Interneuronen im kortikalen Ziel, bietet die Möglichkeit, die lokale neuronale studieren zu beobachten Schaltungen und deren chemischen Eigenschaften. Also, diese raffinierte Methode eignet sich nicht nur zur Visualisierung von hochwertigen neuronale Markierung mit hohem Molekulargewicht BDA durch gegenseitige Nervenbahnen zwischen Thalamus und Großhirnrinde, aber auch erlauben die gleichzeitige Vorführung von andere neuronale Marker mit fluoreszierenden Histochemie oder Immunchemie.

Überleben der 10 Tage Post Einspritzung von BDA in der VPM war ausreichend für die Herstellung von intensiven neuronalen Kennzeichnung auf den entsprechenden kortikalen Areale ipsilateral zur Injektion Seite (Abbildung 2). Sowohl konventionelle ABC und fluoreszierende Färbung Verfahren für BDA offenbart das ähnliche Muster der neuronalen Beschriftung auf der S1, einschließlich Anterogradely mit der Bezeichnung Thalamocortical Axone und doppelthebel mit ...

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Improving the Application of High Molecular Weight Biotinylated Dextran Amine for Thalamocortical Projection Tracing in the Rat

Hier präsentieren wir Ihnen eine raffinierte Protokoll um effektiv biotinylierte Dextran Amin (BDA) Kennzeichnung mit einem fluoreszierenden Färbung Methode durch eine wechselseitige neuronale Weg zu offenbaren. Es ist geeignet für die Analyse der Feinstruktur des BDA Etikettier- und unterscheidet sie von anderen neuralen Elemente unter einem konfokalen Laser-scanning-Mikroskop.

Verbesserung der Anwendung des hochmolekularen Biotinylierte Dextran Amin für Thalamocortical Projektion Tracing in der Ratte

High molecular weight biotinylated dextran amine (BDA) has been used as a highly sensitive neuroanatomical tracer for many decades. Since the quality of ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Die Anwendung eines NMDA-Rezeptor-Leitwert in Rat Mittelhirn dopaminergen Neuronen Mit der Dynamic-Clamp-Technik

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The embryonic chick is a widely used model for the study of peripheral and central ganglion cell projections. In the auditory system, selective labeling ...

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