Name: a caenorhabditis elegans nutritional-status based copper aversion assay
Uploaded: 2017-07-26T13:00:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dal Consiglio di Ricerca delle Scienze Naturali e di Ingegneria del Canada Discovery Grant RGPIN36481-08 a William G. Bendena.

1. Preparazione degli organismi sperimentali <ol><li> Prelevare 10 nematodi in scatola L4 per ceppo 24 h prima di iniziare il test per assicurare che gli organismi siano giovani adulti quando sono stati sottoposti a test. Per ogni mutato o nematodo di controllo sperimentato, scegliere 10 L4s (10 per il controllo e 10 per il saggio). <ol><li> Mantenere gli organismi L4 utilizzando metodi standard 26 , 27 per 24 ore su piatti standard di agar se...

<ol>
	<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).</li><li>Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensation+in+C.+elegans+(October+25,+2006).">Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006).</a> The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. 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J. 5 (12), 1261-1276 (2010).</li><li>O'Reilly, L. P., Luke, C. J., Perlmutter, D. H., Silverman, G. A., Pak, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+in+high-throughput+drug+discovery.">C. elegans in high-throughput drug discovery.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. , 247-253 (2014).</li><li>Thompson, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+million+mutation+project:+a+new+approach+to+genetics+in+Caenorhabditis+elegans.">The million mutation project: a new approach to genetics in Caenorhabditis elegans.</a> Genome Res. 23 (10), 1749-1762 (2013).</li><li>Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+a+circuit+for+olfactory+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. 450 (7166), 63-70 (2007).</li><li>Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+responds+to+chemical+repellents+by+integrating+sensory+inputs+from+the+head+and+the+tail.">C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail.</a> Curr. Biol. 12 (9), 730-734 (2002).</li><li>Hart, A. C., Kass, J., Shapiro, J. E., Kaplan, J. 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Neurosci. 19 (6), 1952-1958 (1999).</li><li>Ishihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HEN-1,+a+secretory+protein+with+an+LDL+receptor+motif,+regulates+sensory+integration+and+learning+in+Caenorhabditis+elegans.">HEN-1, a secretory protein with an LDL receptor motif, regulates sensory integration and learning in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 109 (5), 639-649 (2002).</li><li>Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+chemotaxis+revealed+by+paired+presentation+of+a+chemoattractant+and+starvation+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> J. Exp. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+distinct+amine+receptors+operating+at+different+levels+within+the+locomotory+circuit+are+each+essential+for+the+serotonergic+modulation+of+chemosensation+in+Caenorhabditis+elegans.">Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).</li><li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+serotonergic+food+signal+stimulating+sensory-mediated+aversive+behavior+in+C.+elegans.">Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans.</a> PLoS One. 6 (7), (2011).</li><li>Mitchell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differential+role+for+neuropeptides+in+acute+and+chronic+adaptive+responses+to+alcohol:+behavioural+and+genetic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 5 (5), (2010).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=npr-1+Regulates+Foraging+and+Dispersal+Strategies+in+Caenorhabditis+elegans.">npr-1 Regulates Foraging and Dispersal Strategies in Caenorhabditis elegans.</a> Cell. 18 (21), 1694-1699 (2008).</li><li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+A+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: A new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes Brain Behav. 14 (4), 357-368 (2015).</li><li>Wang, S. J., Wang, Z. 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Questo disegno del dosaggio modifica il test di corsa alimentare 24 per includere una soluzione di rame per creare una barriera media lineare avversa e intorno al bordo della piastra per evitare una perdita di nematodi. Gli organismi sono testati per la loro capacità di attraversare la barriera avversaria e raggiungere una patch di cibo per un periodo di 4 h. Nel contesto di npr-9 (GF) abbiamo utilizzato questo test per valutare come le condizioni di fame potrebbero influenzare le rispo...

Caenorhabditis elegans è stato usato come modello per lo studio della neurobiologia da decenni a causa della relativa facilità nell&#39;analisi della circuiteria di un sistema nervoso composto da soli 302 neuroni 1 . Fintanto che l&#39;organismo è affidato a rispondere alle indicazioni ambientali, gran parte del sistema nervoso è dedicato a regolare l&#39;integrazione dei segnali ambientali 2 . Nonostante la semplicità del suo sistema nervoso, C. elegans può rilevare e rispondere a diversi segnali ambientali, compresi repellenti 3 , attrattivi 4 , temperatura 5 e persino umidità 6 . Un fallimento per integrare correttamente i segnali ambientali è stato collegato a una serie di disturbi del comportamento e delle condizioni neurodegenerative in sistemi modello di mammiferi 7- 9. Con una gamma di modelli di malattie neurali disponibili<html> 10 in C. elegans e lo sviluppo di schermi farmaceutici nematodi 11 , questo organismo si è rivelato un utile sistema per lo studio della neurobiologia. Dato la disponibilità di un mappato connettorio 1 e mutazioni a quasi tutti i genomi del genoma nematode 12 , la nostra comprensione del sistema nervoso nematode, e per estensione la nostra, è parzialmente limitata dalla progettazione di test creativamente appropriati. Negli ultimi 40 anni sono stati sviluppati diversi test di chemotaxis per valutare la reattività del nematode a diversi stimoli avversi 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . La sperimentazione iniziale ha comportato l&#39;introduzione di uno stimolo ambientale acuto, mentre un singolo worm ha percorso un piatto di agar= &quot;Xref&quot;&gt; 3 , 14 , 16 . Sono state registrate modifiche immediate alle risposte locomotorie. Ad esempio, l&#39;odorante volatile dell&#39;ottanolo può essere applicato a un capello e si è spostato di fronte a un naso di nematode per stimolare l&#39;inizio della locomozione all&#39;indietro nei vermi di tipo selvatico 17 . Sono stati inoltre sviluppati test più complessi per incorporare più variabili come mezzo per valutare la scelta comportamentale 18 . Una variante di questo dosaggio comporta l&#39;impiego di una soluzione di rame per creare una barriera avversaria della linea mediana 4 . Un attraente, vale a dire diacetilico, è stato posto su un lato della barriera chimica con vermi trasferiti lontani dalla fonte di diacetile. I vermi difettosi per le risposte aversive di rame immediatamente attraversarono la barriera per raggiungere il diacetil, mentre i vermi di tipo selvaggio furono inizialmente respinti dalla barriera. Le risposte sono state rilevate quando i vermi hanno avvicinato la barriera al rameSenza osservazioni a lungo termine. Quando i vermi vengono valutati dopo essere stati sottoposti a fame, la loro sensibilità agli stimoli ambientali diminuisce 19 . Quando l&#39;ottanolo chimico avversivo viene distrutto davanti al naso nematode, gli organismi di tipo selvatico stimolano il movimento all&#39;indietro entro 3 - 5 s quando sono al cibo. Dopo che questi organismi sono stati rimossi dal cibo per 10 minuti, presentano una risposta ritardata di 8-10 s 20 . Così, con una maggiore fame, i nematodi mostrano una diminuita risposta avversa a segnali ambientali nocivi, poiché la ricerca di cibo diventa più essenziale per la sopravvivenza. Viceversa, i nematodi che il recettore neuropeptidico 9 ( esim-9) eccessivamente esprimono, non rispondono all&#39;ottanolo in o fuori dal cibo e presentano un&#39;incapacità di rispondere ad un certo numero di stimoli avversi 21 . Questi organisms ego-9 (GF) non modulano anche la loro frequenza di inversione in presenza di cibo, ma possonoReverse in risposta a stimoli di tocco duro che indicano che sono in grado di una locomozione indietro 21 . Abbiamo anche valutato i Mutanti z1-9 (LF) dato che presentano una frequenza di inversione anormalmente ridotta al di fuori del cibo, ma possono modulare il loro comportamento in presenza di cibo 21 . Accoppiare lo stato nutrizionale del verme con l&#39;introduzione di stimoli esterni acuti ha contribuito a spiegare i meccanismi attraverso i quali un percorso alimentare può ampiamente modulare i percorsi sensoriali di segnalazione 22 , 23 . La presenza di cibo nell&#39;ambiente nematodi è stata utilizzata anche per valutare le risposte di prelievo di etanolo 24 . In questo esperimento, i vermi sono stati incubati in varie concentrazioni di etanolo e poi sono state poste su un piatto di agar con una patch di alimento conosciuto come un &quot;assaggio della corsa alimentare&quot;. La patch alimentare è stata posta su un bordo della piastra mentre i nematodi wEretta lontano dalla fonte alimentare. Il ritiro di etanolo è stato valutato misurando la durata del tempo necessario per i worm per raggiungere la zona di cibo. Questo test di avversione di rame basata sulla nutrizione si basa sul test sulla corsa alimentare per integrare ulteriori variabili ambientali, vale a dire cibo e rame, valutando nel contempo i cambiamenti comportamentali. Questo è un adattamento di un protocollo di uso comune in tutta la comunità C. elegans 4 . Questo protocollo è stato utilizzato per valutare le risposte avversarie e la rilevazione del cibo durante un periodo di quattro ore 21 . Poiché i vermi mostrano comportamenti di fame dopo 30 minuti di deprivazione alimentare 25 , siamo anche in grado di valutare come le modifiche allo stato nutrizionale possano influenzare le risposte ambientali. Le condizioni di questo dosaggio misurano come gli organismi sperimentali cambino la risposta a stimoli avversi nel tempo, quindi valuta i cambiamenti comportamentaliGli organismi avanzano verso uno stato affamato (e continue misurazioni di fame di lunga durata). Dal momento che gli animali da zo-9 (GF) non alterano il loro comportamento in risposta a cibo oa molti segnali avversi, abbiamo cercato di identificare se questi disfunzioni comportamentali continuerebbero a persistere nel contesto della fame. In definitiva, questo progetto di dosaggio è stato formulato per valutare in modo specifico i mutanti z1-9 (GF), ma può essere ulteriormente adattato anche a caratterizzare nuovi ceppi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="689">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:332px;">M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Produced in lab</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:332px;">Cupric Sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C-1297</td>
			<td style="width:167px;">Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a caenorhabditis elegans nutritional-status based copper aversion assay

Per garantire la sopravvivenza, gli organismi devono essere in grado di evitare habitat sfavorevoli pur garantendo una fonte alimentare coerente. Caenorhabditis elegans altera i loro modelli locomotori sulla rilevazione di diversi stimoli ambientali e può modulare la loro suite di risposte comportamentali in risposta alle condizioni di fame. I nematodi presentano tipicamente una diminuzione della risposta avversa quando vengono rimossi da una fonte alimentare per oltre 30 minuti. L&#39;osservazione dei cambiamenti comportamentali in risposta a un cambiamento dello stato nutrizionale può fornire una visione dei meccanismi che regolano la transizione da uno stato ben nutrito allo stato affamato. Abbiamo sviluppato un saggio che misura una capacità del nematode di attraversare una barriera avversaria ( cioè rame) e quindi raggiungere una fonte di cibo per un lungo periodo di tempo. Questo protocollo si basa sul lavoro precedente integrando più variabili in modo tale da consentire una continua raccolta dei dati quando gli organismi si spostano verso unN condizioni sempre più affamate. Inoltre, questo esame consente una maggiore dimensione del campione in modo che le popolazioni più grandi di nematodi possano essere valutate simultaneamente. Gli organismi difettosi per la capacità di rilevare o reagire al rame attraversano immediatamente la barriera chimica, mentre i nematodi di tipo selvatico vengono inizialmente respinti. Poiché i vermi di tipo selvaggio sono sempre più affamati, iniziano a attraversare la barriera e raggiungere la fonte alimentare. Abbiamo progettato questo test per valutare un mutante incapace di rispondere a varie indicazioni ambientali, tra cui la sensazione di cibo o la rilevazione di sostanze chimiche avverse. Quando vengono valutati tramite questo protocollo, gli organismi difettosi hanno subito attraversato la barriera, ma sono stati anche incapaci di rilevare una fonte di cibo. Quindi, questi mutanti attraversano ripetutamente la barriera chimica nonostante temporaneamente raggiungono una fonte di cibo. Questo test può testare in modo diretto le popolazioni di vermi per valutare i possibili difetti di percorso correlati all&#39;avversione e alla fame.

Utilizziamo il tipo selvatico (N2), npr-9 (tm1652) e un ceppo di sovraespressione npr-9 , cioè npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; -1 :: rfp), per valutare le risposte alla fame e all&#39;avversione di rame. Gli organismi di tipo selvatico sono in grado di rilevare e rispondere alla barriera di rame avversa, mentre i mutanti z-9 (GF) non iniziano una risposta avversaria al rame nel corso del test di 4 ore <sup class="xr...

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A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

UN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Analisi di Aversione di rame basata sullo stato nutrizionale

Qui presentiamo un esame specifico di Caenorhabditis elegans progettato per valutare i cambiamenti nel comportamento avversione di rame e la capacità di individuare una fonte di cibo comune, in quanto l&#39;organismo progredisce da uno stato alimentare ben nutrito e affamato.

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

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Neuroscienze

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A Caenorhabditis elegans Model System for Amylopathy Study

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Sistema modello per Amylopathy Studio

Amylopathy is a term that describes abnormal synthesis and accumulation of amyloid beta (A&beta;) in tissues with time. A&beta; is a hallmark of ...

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Methods for Studying the Mechanisms of Action of Antipsychotic Drugs in Caenorhabditis elegans

Metodi per studiare i meccanismi d&#39;azione di farmaci antipsicotici in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Caenorhabditis elegans is a simple genetic organism amenable to  large-scale forward and reverse genetic screens and chemical genetic screens. The C.  ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Un test per misurare gli effetti di etanolo sulla velocità di Locomotion<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Microchambers Agarose per lungo termine Imaging di calcio<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Un test comportamentale per Mechanosensation di cloni in marcm-based<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Nuovi parametri per caratterizzare embrionale Allungamento del nematode<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Sviluppo di analisi per la quantificazione alto contenuto di formazione aggregata di Sod1 mutante della proteina in cellule viventi

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Raziometrici calcio Imaging di singoli neuroni nel comportarsi Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Imaging delle spine dendritiche in Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...