Name: a caenorhabditis elegans nutritional-status based copper aversion assay
Uploaded: 2017-07-26T13:00:00
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Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Investigación de Ingeniería del Canadá Discovery Grant RGPIN36481-08 a William G. Bendena.

1. Preparación de organismos experimentales <ol><li> Elija 10 L4 de nematodos por cepa 24 h antes de comenzar el ensayo para asegurar que los organismos son adultos jóvenes cuando se prueban. Para cada nematodo mutante o de control ensayado, se seleccionan 10 L4s (10 para el testigo y 10 para el ensayo). <ol><li> Mantener los organismos L4 utilizando métodos estándar 26 , 27 durante 24 h en placas de agar estándar sembradas con OP50 E...

<ol>
	<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).</li><li>Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensation+in+C.+elegans+(October+25,+2006).">Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006).</a> The C. elegans Research Community, WormBook. , (2006).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+a+circuit+for+olfactory+behaviour+in+Caenorhabditis+elegans.">Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. 450 (7166), 63-70 (2007).</li><li>Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+responds+to+chemical+repellents+by+integrating+sensory+inputs+from+the+head+and+the+tail.">C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail.</a> Curr. Biol. 12 (9), 730-734 (2002).</li><li>Hart, A. C., Kass, J., Shapiro, J. E., Kaplan, J. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+distinct+amine+receptors+operating+at+different+levels+within+the+locomotory+circuit+are+each+essential+for+the+serotonergic+modulation+of+chemosensation+in+Caenorhabditis+elegans.">Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).</li><li>Harris, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+serotonergic+food+signal+stimulating+sensory-mediated+aversive+behavior+in+C.+elegans.">Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans.</a> PLoS One. 6 (7), (2011).</li><li>Mitchell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+differential+role+for+neuropeptides+in+acute+and+chronic+adaptive+responses+to+alcohol:+behavioural+and+genetic+analysis+in+Caenorhabditis+elegans.">A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 5 (5), (2010).</li><li>Colbert, H. A., Bargmann, C. 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Este diseño de ensayo modifica el ensayo 24 de raza alimentaria para incluir una solución de cobre para crear una barrera aversiva de línea media y alrededor del borde de la placa para evitar la pérdida de nematodos. Los organismos se ponen a prueba para determinar su capacidad para cruzar la barrera aversiva y alcanzar un parche alimenticio durante un período de 4 h. En el contexto de npr-9 (GF) , hemos utilizado este ensayo para evaluar cómo las condiciones de inanición podrían...

Caenorhabditis elegans se ha utilizado como modelo para el estudio de la neurobiología durante décadas debido a la relativa facilidad en el análisis de los circuitos de un sistema nervioso compuesto por sólo 302 neuronas [ 1] . Siempre que el organismo dependa de responder a señales ambientales, gran parte del sistema nervioso se dedica a regular la integración de las señales ambientales 2 . A pesar de la simplicidad de su sistema nervioso, C. elegans puede detectar y responder a diversas señales ambientales incluyendo repelentes 3 , atrayentes 4 , temperatura 5 e incluso humedad 6 . Un fallo para integrar adecuadamente las señales ambientales se ha relacionado con una serie de trastornos del comportamiento y condiciones neurodegenerativas en los sistemas modelo de mamíferos [ 7 - 9] . Con una gama de modelos disponibles de enfermedad neural<html> 10 en C. elegans y el desarrollo de pantallas farmacéuticas de nematodos 11 , este organismo ha demostrado ser un sistema útil para el estudio de la neurobiología. Dada la disponibilidad de un nematodo asignado 1 y de mutaciones a casi todos los genes del nematodo genoma 12 , nuestra comprensión del sistema nervioso de los nematodos, y por extensión nuestra, está parcialmente limitada por el diseño de ensayos creativamente apropiados. Se han desarrollado varios ensayos de quimiotaxis durante los últimos 40 años para evaluar la respuesta de los nematodos a diversos estímulos aversivos 3 , 4 , 13 , 14 , 15 . La experimentación inicial implicó la introducción de un estímulo ambiental agudo mientras que un solo gusano vagaba sobre una placa de agar= &quot;Xref&quot;&gt; 3 , 14 , 16 . Se registraron cambios inmediatos en las respuestas locomotoras. Por ejemplo, el octanol odorante volátil puede aplicarse a un cabello y ponerse delante de la nariz de un nematodo para estimular el inicio de la locomoción hacia atrás en gusanos de tipo salvaje [ 17] . También se han desarrollado ensayos más complejos para incorporar múltiples variables como medio de evaluar la elección del comportamiento 18 . Una variación de este ensayo implica el uso de una solución de cobre para crear una barrera aversiva de la línea media 4 . Un atrayente, es decir, diacetil, se colocó en un lado de la barrera química con gusanos transferidos lejos de la fuente de diacetilo. Los gusanos defectuosos para las respuestas de aversión al cobre cruzaron inmediatamente la barrera para alcanzar el diacetilo, mientras que los gusanos de tipo silvestre fueron repelidos inicialmente por la barrera. Las respuestas fueron anotadas cuando los gusanos se acercaron por primera vez a la barrera de cobreSin observaciones a largo plazo. Cuando los gusanos son evaluados después de sufrir condiciones de inanición, su sensibilidad a los estímulos ambientales se reduce 19 . Cuando el octanol químico aversivo se deposita frente a la nariz del nematodo, los organismos de tipo silvestre estimulan el movimiento hacia atrás dentro de 3-5 s cuando se alimentan. Después de que estos organismos se han retirado de los alimentos durante 10 min, que muestran una respuesta tardía de 8 - 10 s 20 . Por lo tanto, con el aumento de la inanición, los nematodos muestran una menor respuesta aversiva a las señales ambientales perjudiciales como la búsqueda de alimentos se vuelve más esencial para la supervivencia. Por el contrario, los nematodos que sobreexpresan el receptor neuropéptido 9 ( npr-9) , no responden al octanol en o fuera de los alimentos y muestran una incapacidad para responder a una serie de estímulos aversivos [ 21] . Estos organismos npr-9 (GF) también no modulan su frecuencia de inversión en presencia de alimento, pero puedenInversa en respuesta a los estímulos de tacto áspero que indica que son capaces de locomoción hacia atrás 21 . También hemos evaluado mutantes npr-9 (LF) dado que exhiben una frecuencia anormalmente baja de inversión de la comida, sin embargo, puede modular su comportamiento en la presencia de alimentos [ 21] . El acoplamiento del estado nutricional del gusano con la introducción de estímulos externos agudos ha ayudado a dilucidar los mecanismos por los cuales una vía alimentaria puede modular ampliamente las vías de señalización sensorial 22 , 23 . La presencia de alimentos en el medio ambiente de nematodos también se ha utilizado para evaluar las respuestas de abstinencia de etanol [ 24] . En este experimento, los gusanos se incubaron en diversas concentraciones de etanol y luego se colocaron en una placa de agar con un parche de alimento conocido como un &quot;ensayo de raza alimentaria&quot;. El parche de alimentos se colocó en un borde de la placa, mientras que los nematodos wSe colocan lejos de la fuente de alimento. La retirada de etanol se evaluó midiendo la duración del tiempo requerido para que los gusanos alcanzaran el parche de alimento. Este ensayo de aversión al cobre basado en la nutrición se basa en el ensayo de raza alimentaria para integrar variables ambientales adicionales, a saber, alimentos y cobre, a la vez que se evalúan los cambios de comportamiento a lo largo del tiempo. Esta es una adaptación de un protocolo de uso común en toda la comunidad C. elegans 4 . Este protocolo se ha utilizado para evaluar las respuestas aversivas y la detección de alimentos durante un período de cuatro horas [ 21] . Dado que los gusanos muestran comportamientos de hambre después de 30 minutos de privación de alimentos 25 , también podemos evaluar cómo los cambios en el estado nutricional pueden influir en las respuestas ambientales. Las condiciones de este ensayo miden cómo los organismos experimentales cambian la respuesta a los estímulos aversivos con el tiempo, por lo que se evalúan los cambios de comportamiento comoLos organismos progresan hacia un estado de hambre (y las mediciones continuadas de hambre prolongada). Dado que los animales npr-9 (GF) no alteran su comportamiento en respuesta a alimentos o muchas señales aversivas, buscamos identificar si estos déficits de comportamiento persistirían en el contexto de hambre. En última instancia, este diseño de ensayo se ha formulado para evaluar específicamente los mutantes npr-9 (GF), pero puede adaptarse adicionalmente para caracterizar también cepas nuevas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="689">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="71">
			<td height="71" style="height:71px;width:332px;">M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.]</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Produced in lab</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:332px;">Cupric Sulfate</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C-1297</td>
			<td style="width:167px;">Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a caenorhabditis elegans nutritional-status based copper aversion assay

Para garantizar la supervivencia, los organismos deben ser capaces de evitar los hábitats desfavorables al tiempo que garantizan una fuente de alimento consistente. Caenorhabditis elegans alteran sus patrones locomotores tras la detección de diversos estímulos ambientales y pueden modular su conjunto de respuestas conductuales en respuesta a las condiciones de hambre. Los nematodos presentan típicamente una respuesta aversiva disminuida cuando se eliminan de una fuente de alimento durante más de 30 min. La observación de los cambios de comportamiento en respuesta a un estado nutricional cambiante puede proporcionar una visión de los mecanismos que regulan la transición de un estado bien alimentado a un estado de hambre. Hemos desarrollado un ensayo que mide la capacidad de un nematodo para atravesar una barrera aversiva ( es decir, cobre) y luego alcanzar una fuente de alimento durante un período prolongado de tiempo. Este protocolo se basa en el trabajo previo mediante la integración de múltiples variables de una manera que permite la continua recogida de datos a medida que los organismos se desplazan hacia unN cada vez más hambre. Además, este ensayo permite un aumento del tamaño de la muestra de modo que pueden evaluarse simultáneamente poblaciones mayores de nematodos. Organismos defectuosos para la capacidad de detectar o responder al cobre inmediatamente cruzar la barrera química, mientras que los nematodos de tipo salvaje son inicialmente repelidos. Como gusanos de tipo silvestre son cada vez más hambre, comienzan a cruzar la barrera y llegar a la fuente de alimentos. Hemos diseñado este ensayo para evaluar un mutante que es incapaz de responder a diversas señales ambientales, incluyendo la sensación de alimentos o la detección de productos químicos aversivos. Cuando se evaluaron a través de este protocolo, los organismos defectuosos cruzaron inmediatamente la barrera, pero también fueron incapaces de detectar una fuente de alimento. Por lo tanto, estos mutantes cruzan repetidamente la barrera química a pesar de llegar temporalmente a una fuente de alimento. Este ensayo puede probar directamente las poblaciones de gusanos para evaluar los posibles defectos de la vía relacionados con la aversión y la inanición.

Se utilizaron cepas de tipo salvaje (N2), npr-9 (tm1652) y una cepa de sobreexpresión npr-9 , es decir npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), para evaluar las respuestas a la inanición y la aversión al cobre. Los organismos de tipo salvaje son capaces de detectar y responder a la barrera aversiva de cobre, mientras que los mutantes npr-9 (GF) no inician una respuesta aversiva al cobre durante el ...

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A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

UN<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ensayo de aversión al cobre basado en el estado nutricional

Aquí, presentamos un ensayo específico de Caenorhabditis elegans diseñado para evaluar los cambios en el comportamiento de aversión al cobre y la capacidad de localizar una fuente de alimento común, a medida que el organismo progresa de un estado nutricional bien alimentado a hambriento.

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Research

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Neuroscience

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

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An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Un ensayo para medir los efectos del etanol sobre la velocidad de locomoción<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Agarose Microchambers for Long-term Calcium Imaging of Caenorhabditis elegans

Microcámaras de agarosa para Imagen de calcio a largo plazo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Behavior is controlled by the nervous system. Calcium imaging is a straightforward method in the transparent nematode Caenorhabditis elegans to measure ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Un ensayo de conducta para Mechanosensation de clones en MARCM-basa<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Novel Metrics to Characterize Embryonic Elongation of the Nematode Caenorhabditis elegans

Las métricas para caracterizar nuevos embrionarias Alargamiento del nematodo<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Dissecting the signaling pathways that control the alteration of morphogenic processes during embryonic development requires robust and sensitive metrics. ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Desarrollo de ensayos para cuantificación de contenido alto de Sod1 mutante de la proteína total formación en células vivas

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans

Imagen radiométrica calcio de neuronas individuales en comportamiento Caenorhabditis Elegans

It has become increasingly clear that neural circuit activity in behaving animals differs substantially from that seen in anesthetized or immobilized ...

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Imaging Dendritic Spines in Caenorhabditis elegans

Imágenes de espinas dendríticas en Caenorhabditis elegans

Dendritic spines are specialized sites of synaptic innervation modulated by activity and serve as substrates for learning and memory. Recently, dendritic ...