Name: in situ characterization of shewanella oneidensis mr1 biofilms by salvi and tof-sims
Uploaded: 2017-08-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS at JoVE.com

אנחנו אסירי תודה לקרן של הארץ הפסיפי הלאומי מעבדה (PNNL), מדעי הביולוגיה (EBD) המשימה זרע מעבדה מכוונות למחקר, פיתוח (LDRD) עבור תמיכה גישה אינסטרומנטלית סופק באמצעות הצעה משתמש כללי W. R. ויילי סביבתיים מולקולרית מדעי מעבדה (EMSL). EMSL הוא מתקן משתמש מדעיים לאומיים בחסות את Office הביולוגיים ואת הסביבה מחקר (בער) ב- PNNL. המחברים תודה ד ר Yuanzhao דינג הוכחה לקרוא את כתב היד, מתן משוב שימושי. PNNL מופעל על ידי Battelle על האלמונית תחת חוזה דה-AC05-76RL01830.

1. הכנה של חומרים <ol><li>הכנה של בינוני אבובים <ol><li>בקבוקים סרום (אחד צורך לכל שלוש זקוקים לכל עקומת גדילה והתרבות biofilm) הערה: כפי שצוין במבוא, צמיחה בינוני מתאים לספק את החומרים המזינים הדרושים המתח של חיידקים עניין יכול להיות מנוצל עבור הליך זה; במקרה זה, &#34; nanowires &#34; TSB ללא דקסטרו...

<ol>
	<li>Renner, L. D., Weibel, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physicochemical+regulation+of+biofilm+formation.">Physicochemical regulation of biofilm formation.</a> MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).</li><li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biofilm+matrix.">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).</li><li>Aldeek, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterned+hydrophobic+domains+in+the+exopolymer+matrix+of+Shewanella+oneidensis+MR-1+biofilms.">Patterned hydrophobic domains in the exopolymer matrix of Shewanella oneidensis MR-1 biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (4), 1400-1402 (2013).</li><li>Hua, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+molecular+imaging+of+a+hydrated+biofilm+in+a+microfluidic+reactor+by+ToF-SIMS.">In situ molecular imaging of a hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS.</a> Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).</li><li>Yu, X. Y., Yang, L., Cowin, J. P., Iedema, M., Zhu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systems+and+methods+for+analyzing+liquids+under+vacuum.">Systems and methods for analyzing liquids under vacuum.</a> US Patent. , (2013).</li><li>Yu, X. Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+electrochemical+device+and+process+for+chemical+imaging+and+electrochemical+analysis+at+the+electrode-liquid+interface+in+situ.">Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ.</a> US Patent. , (2014).</li><li>Yang, L., Yu, X. Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+a+hybrid+microfluidic+platform+compatible+for+in+situ+imaging+by+vacuum-based+techniques.">Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques.</a> J Vac Sci Technol A. 29 (6), (2011).</li><li>Yang, L., Yu, X. Y., Zhu, Z. H., Iedema, M. J., Cowin, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+liquid+surfaces+under+vacuum+using+SEM+and+ToF-SIMS.">Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and ToF-SIMS.</a> Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).</li><li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Molecular+Imaging+of+the+Biofilm+and+Its+Matrix.">In Situ Molecular Imaging of the Biofilm and Its Matrix.</a> Anal Chem. , (2016).</li><li>Yang, J., Ghobadian, S., Montazami, R., Hashemi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proceedings of the Asme 11th Fuel Cell Science, Engineering, and Technology Conference, 2013. , (2013).</li><li>Yu, F., Wang, C. X., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+Graphene-Modified+Electrodes+in+Microbial+Fuel+Cells.">Applications of Graphene-Modified Electrodes in Microbial Fuel Cells.</a> Materials. 9 (10), (2016).</li><li>Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Characterization+of+Hydrated+Proteins+in+Water+by+SALVI+and+ToF-SIMS.">In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS.</a> J Vis Exp. (108), e53708 (2016).</li><li>Hill, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Effects of Electron-Transport-System Impairment on Hydrogen Gas Production by the Bacterium Shewanella oneidensis MR-1. , (2007).</li><li>McCormick, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophotovoltaics:+oxygenic+photosynthetic+organisms+in+the+world+of+bioelectrochemical+systems.">Biophotovoltaics: oxygenic photosynthetic organisms in the world of bioelectrochemical systems.</a> Energy Environ Sci. 8 (4), 1092-1109 (2015).</li><li>Liu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+chemical+probing+of+the+electrode-electrolyte+interface+by+ToF-SIMS.">In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS.</a> Lab Chip. 14, 855-859 (2014).</li><li>Keune, K., Hoogland, F., Boon, J. J., Peggie, D., Higgitt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+"added+value"+of+SIMS:+A+mass+spectrometric+and+spectroscopic+study+of+an+unusual+Naples+yellow+oil+paint+reconstruction.">Evaluation of the "added value" of SIMS: A mass spectrometric and spectroscopic study of an unusual Naples yellow oil paint reconstruction.</a> Int J mass Spectrom. 284 (1-3), 22-34 (2009).</li><li>Lee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry Handbook. , 988 (2012).</li><li>Petrovic, M., Barcelo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+anionic+and+nonionic+surfactants,+their+degradation+products,+and+endocrine-disrupting+compounds+in+sewage+sludge+by+liquid+chromatography/mass+spectrometry.">Determination of anionic and nonionic surfactants, their degradation products, and endocrine-disrupting compounds in sewage sludge by liquid chromatography/mass spectrometry.</a> Anal Chem. 72 (19), 4560-4567 (2000).</li><li>Vickerman, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+Imaging+and+Depth+Profiling+by+Mass+Spectrometry--Sims,+MALDI+or+DESI.">Molecular Imaging and Depth Profiling by Mass Spectrometry--Sims, MALDI or DESI.</a> Analyst. 136 (11), (2011).</li><li>Weng, L. T., Bertrand, P., Stonemasui, J. H., Stone, W. E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tof+Sims+Study+of+the+Desorption+of+Emulsifiers+from+Polystyrene+Latexes.">Tof Sims Study of the Desorption of Emulsifiers from Polystyrene Latexes.</a> Surf Interface Anal. 21 (6-7), 387-394 (1994).</li><li>Pe&#241;uelas-Urquides, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+of+Mycobacterium+tuberculosis+crowth.+A+correlation+of+the+optical+measurements+with+colony+forming+units.">Measuring of Mycobacterium tuberculosis crowth. A correlation of the optical measurements with colony forming units.</a> Braz J Microbiol. 44 (1), 287-289 (2013).</li><li>Dohnalkova, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+hydrated+microbial+extracellular+polymers:+comparative+analysis+by+electron+microscopy.">Imaging hydrated microbial extracellular polymers: comparative analysis by electron microscopy.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1254-1262 (2011).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+SEM+and+ToF-SIMS+analysis+of+IgG+conjugated+gold+nanoparticles+at+aqueous+surfaces.">In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces.</a> Surf Interface Anal. 46, 224-228 (2013).</li><li>Yu, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+transient+species+at+the+electrode-electrolyte+interface+by+in+situ+dynamic+molecular+imaging.">Capturing the transient species at the electrode-electrolyte interface by in situ dynamic molecular imaging.</a> Chem Commun. 52 (73), 10952-10955 (2016).</li></ol>

לאחר מזריקים בשלב-יומן, חשוב לבחון את מספר ימים ואת הטמפרטורה שבה תגדל biofilm לפני שזה בריא ועבה מספיק עבור הדמיה, כפי שמתואר בשלב 3.1. הליך זה מכסה במפורש culturing oneidensis ס MR1 biofilm בטמפרטורת החדר; עם זאת שונים בטמפרטורות החדר יכול להשפיע על קצב גידול. לכן, חיוני להשתמש הדמיה אופטית כדי להבין אם biofilm י?...

Biofilms חיידקי הן קהילות הקשורים השטח אשר התפתחו במשך הזמן כהגנה על חיידקים לשרוד משתנה לגירויים פיזיים ועל מכניים שלילית, שבו תאים מסוגלים לצרף ולשרוד בסביבות אפשריות רבות. 1 , 2 Biofilms נחקרות במידה רבה, יש יישומים בתחומים רבים כגון וההתערבות, הנדסה ביו-רפואית, חקלאות, תעשייה מחקר ופיתוח. 1 , 2 . הבנת המיפוי כימי של קהילות חיידקים אלה מורכבים, כולל שלהם (EPS) מתוצרת עצמית חוץ-תאית חומרים פולימריים וסביבתם מים מקומיים-אשכול, חיוני להשגת מדויקת ומפורטת תיאור הפעילות הביולוגית שלהם. 2
Biofilms להתקיים ולגדול בתוך מדינה מאוד רטוב. מהווה אתגר גדול באמצעות ניתוח משטח מבוססי וואקום טכניקות כגון יון משני זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה (תוף-SIMS) עקב הקושי בלימוד נוזלים נדיפים בואקום. כתוצאה מכך, טכניקות מבוססות ואקום ניתוח משטח היה מוגבל כמעט אך ורק ללמוד biofilm דגימות-רק מדינתם מיובשים. עם זאת, ללמוד ממבנה biofilm במצבו מיובשים מעכב החקירה מדויק של microenvironment הביולוגית האמיתית שלו. היא גורמת לעיתים קרובות שינויים דרסטיים EPS biofilm ובטחונו המורפולוגיה, אשר הוכח לאחר השוואת תוצאות המוני ספקטרלי biofilm יבש בחיי עיר ללימודי נוזלי. 3 , 4 מאמר זה מציג פתרון עבור הלומדים biofilms בתוך hydrated במצבן הטבעי על ידי העסקת את השימוש במערכת שלנו לניתוח-נוזלי ואקום ממשק (SALVI),5,6 כור microfluidic את זה מכיל נוזל תחת הממברנה ניטריד (חטא) שלו סיליקון דק ב- microchannel עשוי polydimethylsiloxane (כרונית), ובכך מספק גישה ישירה על הקורה בדיקה יון משני תוך שמירה על שלמות המבנה של המטריקס נוזלי בתוך ואקום . תא 7 , 8
Oneidensis ס מר-1 מוטציה לבטא חלבון פלורסצנטיות ירוק (GFP) נבחר כאורגניזם מודל להמחשה הליך זה biofilm בשל צדדיות מטבולית שלה שימוש נפוץ ב מיקרוביולוגיה סביבתית ושימושית, אשר היה מבוסס בכבדות על יכולת ייחודית שלה עבור הפחתת מתכת והעברת-אלקטרונים חוץ-תאית. 9 , 10 , 11 . בנוסף, הנוכחות של GFP מותרת עבור קל רציפה biofilm-עובי ניטור באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, באמצעות מסנן isothiocyanate (FITC) fluorescein. מחקרים קודמים שלנו הראו עדות של חיידקים זה העדפה מצורף אל החלון חטא שימוש ב operando קרינה פלואורסצנטית הדמיה לצמיחה biofilm בעובי של עד 100 מיקרומטר. 4 , 12 בעוד מאמר זה ידון רק האישור של הנוכחות של biofilm דרך מיקרוסקופ פלורסצנטיות, SALVI הוא תואם עם שיטות דימות אופטי אחרות כגון סופר-רזולוציה קרינה פלואורסצנטית הדמיה (קרי, מובנית תאורה מיקרוסקופ (SIM)9) ו לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ (CLSM) הדמיה4). דימות אופטי יכול לשמש כדי למדוד את עובי biofilm, לקבל תמונה תלת-ממדית של, צורת biofilm כפי שהוא מופיע, המאשרת את עוביו ואת הקשר שלה אל החלון חטא. 9 בזמן GFP נעשה שימוש בניתוח סימס, S. oneidensis ללא GFP על עקומת הגדילה, שימש מדידה זו נדרשת רק של צפיפות אופטית, לא מחייבים כל הדמיה פלורסנט. בדרך כלל, ההבדל בין ה-GFP מתויג, מינים לא מתויגת בתוך עקומת גדילה נמצא חסר חשיבות. בנוסף, בעוד פרוטוקול זה משתמש oneidensis ס מר-1 GFP כאורגניזם מודל כדי לתאר את התהליך, הליך זה מיועד עבור כל זן חיידקי כי ייתכן שיהיה צורך לטיפוח בתוך SALVI. אמנם, לאור הידע של המתח חיידקי צריך, כמה תנאים לצמיחה כגון זמן, טמפרטורת הסביבה חמצן ייתכן שתצטרך להיות שונה כדי להתאים את המתח של חיידקים כדי לשמש. עבור מדיום הגידול, הליך זה משתמש "nanowires" בינוני, tryptic סויה מרק (TSB) ללא דקסטרוז, סויה tryptic אגר (TSA) ללא דקסטרוז culturing. ההרכב של "nanowires" בינוני כבר במיוחד ניסח עבור הצמיחה, ניטור של הרחבות של הקרום ומאז periplasm של oneidensis ס המופיעות לקחת את הצורה של חוטים קטנים, של הקומפוזיציה בינוני הוקם בתוך מחקרים קודמים. 13 , 14
הפרוטוקול הקודם שלנו בב באתרו ToF נוזלי-סימס יש מאויר היתרון שיש SALVI להציע עבור חלבון הנייח וקובץ מצורף החטא, כמו גם פרוטוקול מפורט על הפחתת ניתוח ונתונים תוף-סימס. 12 יותר מאשר לחזור על הצעדים להפחתת נתונים, הנייר הזה ישמש להתמקד במקום הגישה הייחודית של הגדרת וטיפוח biofilms בתוך microchannel SALVI שלנו, כמו גם את השלבים הדמיה לזהות נוכחות biofilm ועובי מוקדמת תוף-סימס לניתוח. בעוד biofilms היה מוגבל בעבר כדי רק מיובש דגימות בתוך התא של מבוססי וואקום את השטח בשיטות אנליטיות, מפורט EPS ו- biofilm כימי מיפוי של biofilms בשידור חי כעת ניתן להשיג בחיי עיר בגלל יכולת חדשה זו.

<table width="2446">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">ToF-SIMS</td>
			<td style="width:260px;">IONTOF</td>
			<td style="width:123px;">TOF.SIMS 5</td>
			<td style="width:1675px;">Resolution:&#62;10,000 m/&#916;m for mass resolution;&#62;4,000 m/&#916;m for high spatial resolution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)</td>
			<td style="width:260px;">Pacific Northwest National Laboratory</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">-80&#176;C Freezer</td>
			<td style="width:260px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">4&#176;C Refrigerator</td>
			<td style="width:260px;">BioCold Scientific</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>COLDBOX1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Orbital Shaker</td>
			<td style="width:260px;">New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td style="width:1675px;">Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Syringe Pump</td>
			<td style="width:260px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:123px;">EW-74905-02</td>
			<td>Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Incubator</td>
			<td style="width:260px;">Barnstead International</td>
			<td style="width:123px;">LT1465X3</td>
			<td>Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Autoclave</td>
			<td style="width:260px;">Getinge</td>
			<td style="width:123px;">533LS</td>
			<td>Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Spectrophotometer</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">4001-000</td>
			<td>GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Biological Safety Cabinet</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">1385</td>
			<td>1300 Series AZ Biological Safety Cabinet</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Fluorescence Microscope</td>
			<td style="width:260px;">Nikon</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">pH Meter</td>
			<td style="width:260px;">Mettler Toledo</td>
			<td style="width:123px;">51302803</td>
			<td>Used to test the pH of the &#8220;nanowires&#8221; medium after finished and before autoclaving.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">PEEK Union</td>
			<td style="width:260px;">Valco</td>
			<td style="width:123px;">ZU1TPK</td>
			<td>For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">5 Axes Sample Stage</td>
			<td style="width:260px;">IONTOF</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Barnstead Nanopure Water Purification System</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">D11921</td>
			<td>ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Pipette</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">21-377-821</td>
			<td>Range: 100 to 1,000 &#181;L.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Pipette Tip</td>
			<td style="width:260px;">Neptune</td>
			<td style="width:123px;">2112.96.BS</td>
			<td>1,000 &#181;L pipette tips</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:389px;height:20px;">Razor Blade Handle</td>
			<td style="width:260px;">Stanley</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Syringe</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">309659</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Syringe</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">309657</td>
			<td>3 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Syringe</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">309646</td>
			<td>5 mL; Used for making the drip chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Syringe</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">309604</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Syringe</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">302830</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Disposable Pipette</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">13-678-11</td>
			<td>25 mL Fisherbrand&#8482; Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Electric Pipette Filler</td>
			<td style="width:260px;">Pipet-aid</td>
			<td style="width:123px;">P-57260</td>
			<td>Vacuum pressure electric serological pipette filler</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Serum Bottle</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">33109-U</td>
			<td>Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Anaerobic Culture Tube</td>
			<td style="width:260px;">VWR</td>
			<td style="width:123px;">89167-178</td>
			<td>Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Rubber Stopper</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">27235-U</td>
			<td>Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Aluminum Crimp Seal (without septum)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">27227-U</td>
			<td>Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Serum Bottle Aluminum Seal Crimper</td>
			<td style="width:260px;">Wheaton</td>
			<td style="width:123px;">224307</td>
			<td>30 mm crimper with standard seal.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">PTFE Tubing</td>
			<td style="width:260px;">Supelco</td>
			<td style="width:123px;">58697-U</td>
			<td>1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Disposable Cuvettes</td>
			<td style="width:260px;">GMBH</td>
			<td style="width:123px;">759085D</td>
			<td>1.5 Ml for use with spectrophotometer.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Needle</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">303015</td>
			<td>22G; used for serum bottle injection.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Needle</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">305120</td>
			<td>23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Shewanella oneidensis MR-1 with GFP</td>
			<td style="width:260px;">N/A</td>
			<td style="width:123px;">N/A</td>
			<td>Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, &#38; Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Ethanol</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">&#160;S25310A</td>
			<td>95% Denatured</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">TSA</td>
			<td style="width:260px;">BD</td>
			<td style="width:123px;">212305</td>
			<td>Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">PIPES Buffer</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P-1851</td>
			<td>Used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S-5881</td>
			<td>Used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Ammonium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A-5666</td>
			<td>Used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P-4504</td>
			<td>Used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Sodium Phosphate Monobasic</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S-9638</td>
			<td>Used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:123px;">S271-3</td>
			<td>Used for &#8220;nanowires&#8221; medium, and used to make mineral solution used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Sodium lactate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">L-1375</td>
			<td>60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">S-5761</td>
			<td>Used to make ferric NTA solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">N-0253</td>
			<td>Used to make ferric NTA solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Iron (III) Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">451649</td>
			<td>Used to make ferric NTA solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">208094</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Manganese (II) Sulfate Monohydrate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">M-7634</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Iron(II) Sulfate Heptahydrate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">215422</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Calcium Chloride Dihydrate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">223506</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Cobalt(II) Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">60818</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Zinc Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">229997</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Copper(II) Sulfate Pentahydrate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">C-8027</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">237086</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Boric Acid</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">B-6768</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Sodium Molybdate Dihydrate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">331058</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Nickel(II) Chloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">339350</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Sodium Tungstate Dihydrate</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">14304</td>
			<td>Used to make minerals solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">D-Biotin</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">47868</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Folic Acid</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">F-7876</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Pyridoxine Hydrochloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">P-9755</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Riboflavin (B2)</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">47861</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Thiamine Hydrochloride</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T-4625</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Nicotinic Acid</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">N4126</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">21210</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Vitamin B12</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">V-2876</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">4-Aminobenzoic Acid</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">A-9878</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:389px;height:21px;">Thioctic Acid</td>
			<td style="width:260px;">Sigma</td>
			<td style="width:123px;">T-1395</td>
			<td>Used to make vitamin solution, used for &#8220;nanowires&#8221; medium {Hill, E.A. 2007}</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in situ characterization of shewanella oneidensis mr1 biofilms by salvi and tof-sims

Biofilms חיידקי הן קהילות השטח-הקשורים נלמדים במידה רבה להבין שלהם (EPS) מתוצרת עצמית חוץ-תאית חומרים פולימריים ותפקידיהם ב מיקרוביולוגיה סביבתית. מחקר זה מתאר שיטה לטפח biofilm המצורף למערכת לניתוח-ממשק נוזלי ואקום (SALVI) ולהשיג בחיי עיר מיפוי כימי של ממבנה biofilm חי על ידי יון משני זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה (תוף-SIMS). פעולה זו מתבצעת באמצעות culturing של חיידקים גם בחוץ וגם בתוך הערוץ SALVI עם ההתקנה המקצועית שלנו, כמו גם באמצעות טכניקות דימות אופטי כדי לזהות את הנוכחות biofilm ואת עובי לפני ניתוח תוף-סימס. התוצאות שלנו להראות הפסגות האופיינית של biofilm Shewanella רטוב במצבו הטבעי, סימון על מים מקומי אשכול הסביבה שלה, כמו גם EPS שאינם שונים באופן דרסטי של biofilm באותו מיובש המדינה. תוצאות אלה מדגימים את יכולת פריצת דרך SALVI המאפשר בחיי עיר biofilm הדמיה במכשיר מבוסס-ואקום כימי הדמיה.

התוצאות נציג לשרת כדי להראות איך לפרופיל כימי של biofilm המצורפת יכול להיות מזוהה לפרש, כפי שהושג דרך תוף-סימס. לאחר התוויית ספקטרה המונית של ייבוא נתונים תוף-סימס, מודגש בקצרה במקטע הליכים, זיהוי שיא וצריך להתנהל כדי להקצות זהויות לכל ערך מ בהתאמה/z. ניתן לבצע זאת באמצעות סקי?...

Watch this Scientific Journal Video about In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS at JoVE.com

In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS

מאמר זה מציג שיטה לגידול ממבנה biofilm עבור בחיי עיר יון משני זמן-של-טיסה ספקטרומטר מסה למיפוי כימי במצב רטוב, מופעל על ידי כור microfluidic, מערכת לניתוח-הממשק ואקום נוזלי. מר Shewanella oneidensis -1 עם פלורסצנטיות ירוק חלבון שימשה כמודל.

בחיי עיר אפיון Biofilms MR1 Shewanella oneidensis על ידי SALVI וסימס תוף

Bacterial biofilms are surface-associated communities that are vastly studied to understand their self-produced extracellular polymeric substances (EPS) ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

In Situ SIMS and IR Spectroscopy of Well-defined Surfaces Prepared by Soft Landing of Mass-selected Ions

בSIMS אתרו וIR ספקטרוסקופיה של משטחים מוגדרים היטב הוכן על ידי רכה נחיתה של יונים המוניים שנבחרו

Soft landing of mass-selected ions onto surfaces is a powerful approach for the highly-controlled preparation of materials that are inaccessible using ...

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

Assessment of Boron Doped Diamond Electrode Quality and Application to In Situ Modification of Local pH by Water Electrolysis

הערכה של בורון מסוממים יהלומי אלקטרודה איכות ובקשה ל<em&gt; באתר</em&gt; שינוי של pH המקומי על ידי אלקטרוליזה המים

Boron doped diamond (BDD) electrodes have shown considerable promise as an electrode material where many of their reported properties such as extended ...

Radiolabeling and Quantification of Cellular Levels of Phosphoinositides by High Performance Liquid Chromatography-coupled Flow Scintillation

Radiolabeling וכימות של רמות סלולריות של Phosphoinositides ידי נצנץ זרימה מצמיד כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים

Phosphoinositides (PtdInsPs) are essential signaling lipids responsible for recruiting specific effectors and conferring organelles with molecular ...

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS

באפיון באתרו של חלבונים מימה במים על ידי Salvi ו TOF-SIMS

This work demonstrates in situ characterization of protein biomolecules in the aqueous solution using the System for Analysis at the Liquid Vacuum ...

Synthesis and Characterization of Supramolecular Colloids

סינתזה ואפיון של קולואידים מולקולריים

Control over colloidal assembly is of utmost importance for the development of functional colloidal materials with tailored structural and mechanical ...

Characterizing Electron Transport through Living Biofilms

אפיון תחבורה אלקטרון דרך חיים Biofilms

Here we demonstrate the method of electrochemical gating used to characterize electrical conductivity of electrode-grown microbial biofilms under ...

In Situ Characterization of Boehmite Particles in Water Using Liquid SEM

In Situ Characterization of Boehmite Particles in Water Using Liquid SEM

בחיי עיר איפיון חלקיקים Boehmite במים באמצעות נוזלי SEM

In situ imaging and elemental analysis of boehmite (AlOOH) particles in water is realized using the System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

Microfluidic שבבים עבור בחיי עיר קריסטל רנטגן עקיפה ו בחיי עיר פיזור אור דינאמי עבור קריסטלוגרפיה טורי

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

שיפור האות Nanoprobe מהירה על ידי באתרו בתוך Nanoparticle זהב סינתזה

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of F&#8722;

Photoelectron Imaging of Anions Illustrated by 310 Nm Detachment of FÃƒÆ’Ã‚Â¢Ãƒâ€¹Ã¢â‚¬Â '

Photoelectron הדמיה של אניונים מאויר על ידי ניתוק 310 ננומטר F−

Anion photoelectron imaging is a very efficient method for the study of energy states of bound negative ions, neutral species and interactions of unbound ...