Name: determination of the optimal chromosomal location(s) for a dna element in escherichia coli using a novel transposon-mediated approach
Uploaded: 2017-09-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach at JoVE.com

המחברים היו במימון מלגות קרן נובו נורדיסק, קרן לונדבק, דנית מחקר הקרן הלאומית (DNRF120) דרך המרכז תגובת המתח חיידקי, התמדה (BASP).

1. האוסף של ספריית Transposon הערה: מיקומה DARS2 כרומוזומליות היה משובטים לתוך ה Tn מיני 10-מבוסס transposon, NKBOR (על pNKBOR) 21, וכתוצאה מכך NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR ניתן להשיג באינטרנט 22. pNKBOR הוא וקטור התאבדות מבוססי R6K הדורשת את π חלבון יוזם עבור שכפול <sup class="xref"...

<ol>
	<li>Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+bacterial+chromosome+replication+by+non-coding+regions+outside+the+origin.">Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin.</a> Curr Genet. , (2016).</li><li>Sherratt, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+and+chromosome+segregation.">Recombination and chromosome segregation.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).</li><li>Bigot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+motifs+that+control+E.+coli+chromosome+segregation+by+orienting+the+FtsK+translocase.">DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase.</a> EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).</li><li>Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Replication+Control+Is+Linked+to+Genomic+Positioning+of+Control+Regions+in+Escherichia+coli.">DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli.</a> PLoS Genet. 12 (9), 1006286 (2016).</li><li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA Replication, Second Edition. , (1992).</li><li>Kaguni, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+initiation+at+the+Escherichia+coli+chromosomal+origin.">Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin.</a> Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).</li><li>Leonard, A. C., Grimwade, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DnaA+assembly+and+activity:+taking+directions+from+the+genome.">Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome.</a> Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).</li><li>Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+cycle-coordinated+change+of+the+adenine+nucleotide-bound+forms+of+DnaA+protein+in+Escherichia+coli.">Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli.</a> EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).</li><li>Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+activates+dnaA+protein+in+initiating+replication+of+plasmids+bearing+the+origin+of+the+E.+coli+chromosome.">ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome.</a> Cell. 50 (2), 259-265 (1987).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).</li><li>Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeqA:+a+negative+modulator+of+replication+initiation+in+E.+coli.">SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli.</a> Cell. 77 (3), 413-426 (1994).</li><li>Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initiator+function+of+DnaA+protein+is+negatively+regulated+by+the+sliding+clamp+of+the+E.+coli+chromosomal+replicase.">The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase.</a> Cell. 94 (1), 61-71 (1998).</li><li>Kato, J., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hda,+a+novel+DnaA-related+protein,+regulates+the+replication+cycle+in+Escherichia+coli.">Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli.</a> EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).</li><li>Kasho, K., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaA+binding+locus+datA+promotes+DnaA-ATP+hydrolysis+to+enable+cell+cycle-coordinated+replication+initiation.">DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).</li><li>Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+control+of+replication+initiation+by+a+novel+chromosomal+locus+exhibiting+exceptional+affinity+for+Escherichia+coli+DnaA+protein.">Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein.</a> Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).</li><li>Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+genomic+sequences+of+E.+coli+promote+replicational+initiation+by+directly+reactivating+ADP-DnaA.">Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA.</a> Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).</li><li>Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timely+binding+of+IHF+and+Fis+to+DARS2+regulates+ATP-DnaA+production+and+replication+initiation.">Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation.</a> Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).</li><li>Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+regions+for+chromosome+replication+are+conserved+with+respect+to+sequence+and+location+among+Escherichia+coli+strains.">Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains.</a> Front Microbiol. 6, 1011 (2015).</li><li>Bergthorsson, U., Ochman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+chromosome+length+variation+in+natural+isolates+of+Escherichia+coli.">Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli.</a> Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).</li><li>Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+bacteria:+a+promising+tool+in+experimental+and+clinical+microbiology.">Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology.</a> J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).</li><li>Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKBOR,+a+mini-Tn10-based+transposon+for+random+insertion+in+the+chromosome+of+Gram-negative+bacteria+and+the+rapid+recovery+of+sequences+flanking+the+insertion+sites+in+Escherichia+coli.">NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli.</a> Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).</li><li>Shafferman, A., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+properties+of+the+beta+origin+of+replication+of+plasmid+R6K.">Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K.</a> J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).</li><li>Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+protocol+for+preparation+of+electrocompetent+Escherichia+coli+and+Vibrio+cholerae.">Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li><li>Smith, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+primed+labeling+of+DNA.">Random primed labeling of DNA.</a> Methods Mol Biol. 18, 445-447 (1993).</li><li>Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+replication+incompatibility+in+Dam+methyltransferase+deficient+Escherichia+coli+cells.">Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells.</a> EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).</li><li>Harrison, R. W., Miller, J. C., D'Souza, M. J., Kampo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+gene+walking.">Easy gene walking.</a> Biotechniques. 22 (4), 650-653 (1997).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+local+alignment+search+tool.">Basic local alignment search tool.</a> J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).</li><li>Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+right+half+of+the+Escherichia+coli+replication+origin+is+not+essential+for+viability,+but+facilitates+multi-forked+replication.">The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication.</a> Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).</li><li>Lobner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+minichromosomes+in+individual+Escherichia+coli+cells:+implications+for+replication+control.">Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control.</a> EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).</li><li>Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DnaA+protein+determines+the+initiation+mass+of+Escherichia+coli+K-12.">The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12.</a> Cell. 57 (5), 881-889 (1989).</li><li>Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAPlotter:+circular+and+linear+interactive+genome+visualization.">DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization.</a> Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).</li><li>Eckert, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+application+of+transposon-directed+insertion+site+sequencing+to+a+library+of+signature-tagged+mini-Tn5Km2+mutants+of+Escherichia+coli+O157:H7+screened+in+cattle.">Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle.</a> J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).</li><li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn-seq:+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms.">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).</li><li>van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+insertion+sequencing:+a+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms.">Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).</li><li>Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+Adaptive+Laboratory+Evolution+of+Microorganisms+Using+a+Chemostat.">Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat.</a> J Vis Exp. (115), (2016).</li><li>Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+position+effects+on+gene+expression+in+Escherichia+coli+K-12.">Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12.</a> Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).</li><li>Blattner, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+genome+sequence+of+Escherichia+coli+K-12.">The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li></ol>

המתודולוגיה בשימוש כאן מנצל המדינה-of-the-art טכניקות כדי לענות על שאלה קשה בנוגע המיקום האופטימלי גנומית של רכיב גנטי. הכניסה אקראי של הרכיב הגנטי (בתיווכו של transposon) מאפשר את האוסף קלה ומהירה של אלפי שיבוטים, אשר לאחר מכן ניתן יהיה לעשות מתחרות זו בזו כדי לבחור את המיקום האופטימלי של הרכיב הגנ?...

הפונקציה של כל רכיב גנטי עשויה להיות מושפעת מיקומו הגנום. בחיידקים, זה בעיקר נובע הפרעה על ידי שעתוק של גנים השכן, טופולוגיה DNA מקומיים, ו/או הקשורים שכפול גנטי המינון. בפרט, תהליכי שכפול ה-DNA, סגרגציה נשלטים, לפחות בחלקו, לפי אזורים כרומוזומלית ללא קידוד1ו לתפקוד תקין של אזורים אלה תלוי מיקום גנומית/הקשר. ב- e. coli, דוגמאות באתר dif , הדרושים עבור אחותי ברזולוציה של כרומוזום2; רצפים KOPS, נדרש כרומוזום סגרגציה3; ואת הנתונים, DARS1ואזורי DARS2 , הנדרשים לשליטה נכונה הכרומוזום (להלן; 4). אנו מציגים שיטה ומאפשר רילוקיישן אקראי, בחירה ונחישות של הקשר הגנטי אופטימלית של כל רכיב גנטי מסוים, כאן כשניסחתי חקר האזור ללא קידוד DARS2 .
ב- e. coli, DnaA הוא החלבון יוזם ממונה על צירוף ד. נ פתיחת שכפול יחיד מוצאoriC, ועל הגיוס של הליקאז DnaB5,6,7. DnaA שייך AAA+ (קרי, ATPases הקשורים עם פעילויות מגוונות) חלבונים יכולים לאגד הן ATP ו ADP עם גבוה דומה הזיקות5. הרמה של DnaAATP פסגות-חניכה8, איפה DnaAATP מתפתח multimer על oriC , זה מעורר דנ א דופלקס פתיחה9. לאחר החניכה, oriC עשוי אינו זמין באופן זמני עבור אתחול מחדש עקב פחמיות באמצעות מנגנון המערבים את הכריכה של החלבון SeqA כדי hemimethylated oriC10,11. במהלך פחמיות, הרמה של DnaAATP הוא מופחת על ידי לפחות שני מנגנונים: איון הרגולציה של 12,DnaA (רידא)13 ונתונים-תלוי DnaAATP הידרוליזה (DDAH)14 ,15. רידא והן DDAH לקדם את ההמרה של DnaAATP DnaAADP. לפני סבב חדש של חניכה, DnaAADP הוא מופעל מחדש כדי DnaAATP -רצפים ספציפיים הפעלה מחדש-של DnaA (DARS):16, DARS1 ו- DARS217. כרומוזומלית נתונים, DARS1, וDARS2 הם ללא קידוד ולהתנהג בצורה דמוית המלווה כדי לווסת את DnaAATP/DnaAADP interconversion. אזורים אלה, הממוקם מחוץ המקור של שכפול, לאפשר ההרכבה של DnaA מורכבים גם איון (נתונים; 14) או ההפעלה (DARS1 , DARS2; 17) של DnaA. מחיקת DARS2 בתא אינו משנה זמן ההכפלה המוני, אך יוצרת שכפול אסינכרוני חניכה15,16,18. עם זאת, DARS2-הלקוי ולתאים יש כושר בהשוואה wildtype isogenic אחרת במהלך שני תחרות צמיחה מתמשכת במדיום עשיר או במהלך הקמת מושבת המעי העכבר18. אפשרות זו מציינת כי שינויים קלים אפילו בריכוז asynchrony/מקור יש השפעה שלילית על כושר חיידקי. E. coli, יש לחץ סלקטיבי כדי לשמור על סימטריה (קרי, שני אורך כמעט שווה שכפול נשק) כרומוזום19. הנתונים, DARS1ואזורי DARS2 יש את המרחק היחסי באותו oriC בתוך כל e. coli זנים וסודרו18, למרות וריאציות גדול בגודל כרומוזום.
כאן, אנו משתמשים האזור DARS2 של e. coli כדוגמה לצורך זיהוי position(s) כרומוזומלית האופטימלית עבור תפקידה. DARS2 הוכנס לתוך transposon את NKBOR, את NKBOR תוצאות:: transposonDARS2 לאחר מכן מוכנס באופן אקראי לתוך הגנום של MG1655 ΔDARS2. לכן יצרנו אוסף של תאים, פו-טי כל DARS2 להציב במקום אחר על כרומוזום ה. במבחנה תחרות ניסוי, בו כל התאים באוסף היו איחדו, התחרו אחד נגד השני במהלך צמיחה מתמשכת ב- LB דורות 700 מוערך, בוצעה. תוצאת הניסוי תחרות פיקוח/נקבע באמצעות תספיג דנ א, ג'ין קל הליכה רצף הגנום כולו (WGS; איור 1). שיבוטים מובילים נפתרה על ידי ג'ין קל הליכה התאפיינו cytometry זרימה כדי להעריך את מחזור התא בפרמטרים. בניתוח cytometric זרימה, ניתן למדוד גודל תא, תוכן ה-DNA, חניכה synchrony עבור מספר גדול של תאים. במהלך cytometry זרימה, עובר זרם של תאים בודדים קרן אור של הגל המתאים כדי לרגש מוכתם הדנ א, אשר לאחר מכן נרשם בו זמנית על-ידי photomultipliers אוספים את הנפלט פלורסצנטיות, מידה של תוכן ה-DNA, בתנאי תאים מוכתמים לדנ א. האור מפוזר-קדימה הוא מדד של המוני תאים20.
במבחנה תחרות הניסוי שאנו מציגים כאן משמש כדי לטפל בשאלות המתייחסות חשיבות המיקום כרומוזומליות ואת ההקשר גנומית של רכיב גנטי. השיטה זו לא משוחד, קל לשימוש.

<table width="819">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Autoclaved Mili-Q water</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:119px;">None</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Electroporation Cuvettes, 0.1 cm</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P41050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Bio-Rad MicroPulser Electroporation System</td>
			<td style="width:164px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">LB Broth</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12780029&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">LB Agar, powder (Lennox L agar)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22700025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Glycerol</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Fisherbrand&#160;Plastic Petri Dishes</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S33580A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Nunc&#160;CryoTubes</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">V7634&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">dATP, [&#945;-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 &#181;Ci</td>
			<td style="width:164px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU012H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">DECAprime II DNA Labeling Kit</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM1455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Spectrophotometer&#160; SF/MBV/03.32</td>
			<td style="width:164px;">Pharmacia</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Hermle Centrifuge&#160;&#160;&#160; SF/MBV/03.46</td>
			<td style="width:164px;">Hermle</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Ole Dich Centrifuge&#160; SF/MBV/03.29</td>
			<td style="width:164px;">Ole Dich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Eppendorftubes 1.5 mL</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Eppendorftubes 2.0 mL</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T2795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">96% Ethanol</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">16368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Trizma HCl</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T-3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Phenol Ultra Pure</td>
			<td>BRL</td>
			<td>5509UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Ribonuclease A type II A</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Sodiumdodecylsulphate (SDS)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>13760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L 6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>405-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">0.5M Na-EDTA pH 8.0</td>
			<td>BRL</td>
			<td>5575 UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10106801001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">PvuI (10 U/&#181;L)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Tris-Borate-EDTA buffer</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">433160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Whatman&#160;3MM papers</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WHA3030931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">SSC Buffer 20&#215; Concentrate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Amersham Hybond-N+</td>
			<td style="width:164px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">RPN119B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Ficoll&#160;400</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Bovine Serum Albumin - Fraction V</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">85040C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Carestream Kodak &#160;BioMax &#160;light film</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z373494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">GenElute &#160;Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">NA1111&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">GenElute &#160;PCR Clean-Up Kit</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">NA1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">T100&#160; Thermal Cycler</td>
			<td style="width:164px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:164px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">34514.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Cephalexin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Mithramycin</td>
			<td style="width:164px;">Serva</td>
			<td>29803.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">246964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Apogee A10 instrument</td>
			<td style="width:164px;">Apogee</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the optimal chromosomal location(s) for a dna element in escherichia coli using a novel transposon-mediated approach

Position(s) כרומוזומליות אופטימלית של רכיב ה-DNA נתון היה/נקבעו על ידי הכניסה אקראי בתיווך transposon ואחריו כושר בחירה. בחיידקים, ההשפעה של הקשר הגנטי על הפונקציה של רכיב גנטי יכול להיות קשה להעריך. מספר מנגנונים, כולל אפקטים טופולוגי, מהפרעות תעתיק של גנים השכן, ו/או הקשורים שכפול גנטי המינון, עלול להשפיע על הפונקציה של רכיב גנטי נתון. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשרת שילוב אקראי של רכיב ה-DNA לתוך הכרומוזום של Escherichia coli , בחר המיקומים מאהדה ביותר באמצעות תחרות גדילה פשוטה להתנסות. השיטה מנצלת מערכת מבוססת transposon היטב תיאר של הכניסה אקראי, יחד עם מבחר clone(s) ביותר על ידי צמיחה יתרון, הליך ניתנת להתאמה בקלות לצרכים ניסיוני. מהות clone(s) בכושר יכול להיקבע על ידי רצף הגנום כולו על אוכלוסיה מרובת המשובטים מורכבים או ג'ין קל של זיהוי מהיר של שיבוטים שנבחרו. כאן, באזור ה-DNA ללא קידוד DARS2, השולטת אתחול של הכרומוזום ב e. coli, שימש כדוגמה. הפונקציה של DARS2 ידוע להיות מושפעות המינון הקשורים שכפול גנטי; קרובה יותר DARS2 על מוצאם של שכפול ה-DNA, פעיל יותר זה נעשה. DARS2 הוכנס באופן אקראי לתוך הכרומוזום של DARS2-נמחק זן. שיבוטים הנובעת המכילה הוספות בודדים היו איחדו, התחרו אחד נגד השני במשך מאות דורות. לבסוף שיבוטים בכושר היו מאופיין, יתחוור DARS2 מוכנס בסמיכות למיקום DARS2 המקורי.

תספיג דנ א נעשתה כדי לוודא DARS2 הופץ באופן אקראי בכל הכרומוזום בספריה transposon (t = 0) וכי שיבוטים בכושר נמשכות לאורך זמן. תספיג דנ א בוצעה ב- DNA שחולצו מן הבריכה transposon הראשונית (ב- t = 0), כל 100 מוערך מתוך 700 דורות של תחרות (איור 3). כאן לדנ א הסלולר סך כל הזמן-נקודה ה...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach at JoVE.com

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

. כאן, עוצמת הכניסה אקראי בתיווך transposon של רכיב ה-DNA ללא קידוד שימש כדי לפתור את מעמדה כרומוזומלית אופטימלית.

קביעת Location(s) כרומוזומלית האופטימלית עבור רכיב ה-DNA ב- Escherichia coli באמצעות גישה מוזרה בתיווך Transposon

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

ניתוח של סטיות כרומוזומליות Matter הנגרמת חלקיקי אמביינט שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; מערכת

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

קביעת הגנום כולו של תזמון שכפול יונק ידי מדידת תוכן DNA

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

בגישה מוטגנזה מכוונת רוויה הרומן: אפיון צעד בודד של חלבון תקינה מחייב אתרים ב- RNA באמצעות Phosphorothioates

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

הפקת ג'ין מחיקות ב- Escherichia coli מאת P1 התמרה חושית עם קלטות עמידות לאנטיביוטיקה ניתן לניתוח

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

In vivo היישום של מערכת שליטה מרחוק עבור הביטוי מניפולציה של ג'ין אנדוגני

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

ניתוחים פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה משימוש במסד הנתונים OpenProt לחשוף את הרומן חלבונים מתורגם ממסגרות קאנונית קריאה פתוחה

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

שימוש ברקמות קפואות בתוך שיטת שביט להערכת נזק לדנ א

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...