Name: determination of the optimal chromosomal location(s) for a dna element in escherichia coli using a novel transposon-mediated approach
Uploaded: 2017-09-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach at JoVE.com

저자는 세균성 긴장 응답 및 지 속성 (BASP) Novo Nordisk 기초, Lundbeck 재단 그리고 센터를 통해 덴마크 국립 연구 재단 (DNRF120)에서 교부 금에 의해 투자 되었다.

1. Transposon 도서관의 컬렉션 참고: 염색체 DARS2 로커 스 미니 테네시 10으로 복제 했다-transposon, NKBOR (pNKBOR)에 21, 결과 기반으로 NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR 온라인 22 얻어질 수 있다. pNKBOR 복제 23 시작자 단백질 π를 필요로 하는 R6K 기반 자살 벡터 이다. 플라스 미드 pJFM1는 따라서 pir 유전자의 염색체 ...

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	<li>Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+bacterial+chromosome+replication+by+non-coding+regions+outside+the+origin.">Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin.</a> Curr Genet. , (2016).</li><li>Sherratt, D. 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C., Grimwade, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DnaA+assembly+and+activity:+taking+directions+from+the+genome.">Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome.</a> Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).</li><li>Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+cycle-coordinated+change+of+the+adenine+nucleotide-bound+forms+of+DnaA+protein+in+Escherichia+coli.">Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli.</a> EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).</li><li>Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+activates+dnaA+protein+in+initiating+replication+of+plasmids+bearing+the+origin+of+the+E.+coli+chromosome.">ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome.</a> Cell. 50 (2), 259-265 (1987).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).</li><li>Lu, M., Campbell, J. 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G., von Meyenburg, K., Boye, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DnaA+protein+determines+the+initiation+mass+of+Escherichia+coli+K-12.">The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12.</a> Cell. 57 (5), 881-889 (1989).</li><li>Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAPlotter:+circular+and+linear+interactive+genome+visualization.">DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization.</a> Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).</li><li>Eckert, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+application+of+transposon-directed+insertion+site+sequencing+to+a+library+of+signature-tagged+mini-Tn5Km2+mutants+of+Escherichia+coli+O157:H7+screened+in+cattle.">Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle.</a> J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).</li><li>van Opijnen, T., Bodi, K. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+genome+sequence+of+Escherichia+coli+K-12.">The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li></ol>

여기에서 사용 하는 방법론-의 상태--예술 기법 유전적 요소의 최적의 게놈 위치에 대 한 어려운 질문에 대답을 활용 합니다. 유전자 요소 (중재는 transposon)의 임의 삽입 수 클론 다음 조사 유전 요소의 최적의 위치를 위해 선택 하는 서로 대하여 경쟁 하기 위해 만들 수 있는 수천의 신속 하 고 쉽게 컬렉션 (즉 적자 클론).
여기, DARS2 미니-테네시10에 삽입 된...

어떤 유전적 요소의 기능 게놈에 있는 그것의 위치에 따라 달라질 수 있습니다. 박테리아에이 주로 결과 방해에서 인접 유전자, 로컬 DNA 토폴로지 및 복제 관련 유전자 노출량의 전사에 의해. 특히, DNA 복제 및 분리의 프로세스 제어, 적어도 부분에서 비 코딩 염색체 지역별1, 그리고이 지역의 적절 한 기능에 따라 달라 집니다 genomic 위치/컨텍스트. 대장균, 예제에서는 여동생에 필요한 dif 사이트 염색체 해상도2; KOPS 시퀀스, 염색체 분리3;에 필요한 및 데이터, DARS1및 DARS2 지역, (아래; 적절 한 염색체 복제 제어에 필요한 4). 우리 여기 DARS2 비 코딩 영역의 연구에 의해 exemplified 임의의 이전, 선택, 그리고 어떤 주어진된 유전 요소의 최적의 유전자 맥락의 결정에 대 한 허용 하는 방법 제시.
대장균, DnaA에 시작자 단백질은 DNA 물가는 단일 복제 원점오릭스, 여 helicase DnaB5,,67의 채용에 대 한 책임. DnaA AAA+ (즉, 다양 한 활동과 관련 된 ATPases)에 속하는 단백질 유사한 높은 ATP 그리고 ADP를 바인딩할 수 및 화력5. DnaAATP 수준 개시8, DnaAATP 에 multimer를 형성에서 봉우리 오릭스 는 DNA 이중 오프닝9트리거합니다. 개시, 후 오릭스 hemimethylated SeqA 단백질의 바인딩을 포함 하는 메커니즘에 의해 격리로 인해 다시 개시에 대 한 일시적으로 사용할 수 없게 만든 오릭스10,11. 격리, 동안 DnaAATP 의 수준을 적어도 두 가지 메커니즘에 의해 감소 된다: DnaA (RIDA)12,13 및 데이터의 규제 비활성화-종속 DnaAATP 가수분해 (DDAH)14 ,15. RIDA와 DDAH 홍보 DnaAADPDnaAATP 의 변환. 개시의 새로운 라운드 전에 DnaAADP 는 특정 DnaA 재가동 시퀀스 (DARS)에 DnaAATP 를 재가동: DARS1 및 DARS216,17. 염색체 데이터, DARS1및 DARS2는 비 코딩 지역과 DnaAATP를 변조 하는 보호자와 같은 방식으로 행동 /DnaAADP interconversion. 복제의 근원 밖에이 지역 활성화 DnaA 복잡 한 어셈블리 중 하나에 대 한 비활성화 (데이터, 14) 또는 활성화 (DARS1 및 DARS2; 17) DnaA의. DARS2 셀에서 삭제 대량 배로 시간 되지만 비동기 복제 개시15,,1618변경 되지 않습니다. 그러나, DARS2-결핍 세포는 피트 니스는 풍부한 매체에서 모두 지속적인 성장 경쟁 하는 동안 또는 마우스 내장18에 있는 식민지의 설립 동안에 그렇지 않으면 isogenic wildtype에 비해 비용. 이 비동기/근원 농도에 사소한 변화 세균성 체력에 부정적인 효과 나타냅니다. 대장균, 선택적 압력 유지 염색체 대칭 (즉, 두 거의 같은 길이의 복제 팔)19있다. 데이터, DARS1및 DARS2 지역에 동일한 상대 거리는 오릭스 모든 대장균 변종 시퀀싱18, 염색체 크기에 큰 변화에도 불구 하 고.
여기, 우리가 그것의 기능에 대 한 최적의 염색체 position(s)의 식별에 대 한 예를 들어 대장균 의 DARS2 지역을 사용합니다. DARS2 NKBOR transposon 및 결과 NKBOR에 삽입 되었다: MG1655의 게놈에 무작위로 삽입 이후DARS2 transposon ΔDARS2. 우리는 따라서 셀의 컬렉션을 생성, 각 보유 DARS2 염색체에 다른 위치에 배치 합니다. 생체 외에서 경쟁 실험, 어디는 컬렉션에 있는 모든 셀 풀링된 되었고 약된 700 세대에 대 한 파운드에서 지속적인 성장을 하는 동안 서로 대하여 경쟁, 수행 되었다. 경쟁 실험의 결과 모니터링/결정 했다 남쪽 오 점, 쉬운 유전자 산책, 그리고 전체 게놈 시퀀싱 (WGS;를 사용 하 여 그림 1)입니다. 끝점 클론 쉬운 유전자 걸어서 해결 cytometry 세포 주기 매개 변수를 평가 하 여 특징 이었다. 흐름 cytometric 분석에 많은 수의 셀에 대 한 셀 크기, DNA 콘텐츠 및 개시 synchrony를 측정할 수 있습니다. Cytometry, 하는 동안 단일 셀의 흐름은 다음 동시에 등록 내보낸된 형광 DNA 콘텐츠, 측정을 수집 하는 photomultipliers에 의해 제공, 스테인드 DNA를 자극 하는 적절 한 파장의 광선 전달 합니다 세포는 DNA에 물 들 다. 앞으로 흩어져 빛 셀 대량20의 측정 이다.
생체 외에서 경쟁 실험 선물이 여기 염색체 위치 및 유전 요소의 게놈 맥락의 중요성에 관한 문제를 해결 하는 데 사용 됩니다. 방법은 공평 하 고 사용 하기 쉬운입니다.

<table width="819">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Autoclaved Mili-Q water</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:119px;">None</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Electroporation Cuvettes, 0.1 cm</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P41050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Bio-Rad MicroPulser Electroporation System</td>
			<td style="width:164px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">LB Broth</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12780029&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">LB Agar, powder (Lennox L agar)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22700025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Glycerol</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Fisherbrand&#160;Plastic Petri Dishes</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S33580A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Nunc&#160;CryoTubes</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">V7634&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">dATP, [&#945;-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 &#181;Ci</td>
			<td style="width:164px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU012H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">DECAprime II DNA Labeling Kit</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM1455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Spectrophotometer&#160; SF/MBV/03.32</td>
			<td style="width:164px;">Pharmacia</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Hermle Centrifuge&#160;&#160;&#160; SF/MBV/03.46</td>
			<td style="width:164px;">Hermle</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Ole Dich Centrifuge&#160; SF/MBV/03.29</td>
			<td style="width:164px;">Ole Dich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Eppendorftubes 1.5 mL</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Eppendorftubes 2.0 mL</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T2795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">96% Ethanol</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">16368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Trizma HCl</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T-3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Phenol Ultra Pure</td>
			<td>BRL</td>
			<td>5509UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Ribonuclease A type II A</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Sodiumdodecylsulphate (SDS)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>13760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L 6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>405-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">0.5M Na-EDTA pH 8.0</td>
			<td>BRL</td>
			<td>5575 UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10106801001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">PvuI (10 U/&#181;L)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Tris-Borate-EDTA buffer</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">433160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Whatman&#160;3MM papers</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WHA3030931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">SSC Buffer 20&#215; Concentrate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Amersham Hybond-N+</td>
			<td style="width:164px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">RPN119B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Ficoll&#160;400</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Bovine Serum Albumin - Fraction V</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">85040C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Carestream Kodak &#160;BioMax &#160;light film</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z373494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">GenElute &#160;Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">NA1111&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">GenElute &#160;PCR Clean-Up Kit</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">NA1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">T100&#160; Thermal Cycler</td>
			<td style="width:164px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:164px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">34514.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Cephalexin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Mithramycin</td>
			<td style="width:164px;">Serva</td>
			<td>29803.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">246964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Apogee A10 instrument</td>
			<td style="width:164px;">Apogee</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the optimal chromosomal location(s) for a dna element in escherichia coli using a novel transposon-mediated approach

특정된 DNA 요소의 최적의 염색체 position(s)는 / transposon 중재 무작위 삽입 휘트니스 선택에 의해 다음에 의해 결정 되었다. 박테리아, 유전적 요소의 기능에 유전 맥락의 영향을 평가 하기 위해 어려울 수 있습니다. 토폴로지 효과, 이웃 유전자 또는 유전자 복제 관련 된 복용량, transcriptional 방해를 포함 하 여 몇 가지 메커니즘 주어진 유전적 요소의 기능 영향을 줄 수 있습니다. 여기, 대장균 및 간단한 성장 경쟁을 사용 하 여 가장 유리한 위치 실험 선택의 염색체에 DNA 요소의 임의의 통합을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 메서드를 사용 하면 임의의 삽입, 성장 혜택, 실험적인 요구에 쉽게 조절 절차 적자 clone(s)의 선택과 결합의 잘 설명된 transposon-기반 시스템의 활용. 복잡 한 다중 클론 인구에 전체 게놈 시퀀싱 또는 선택 된 클론의 급속 한 식별에 대 한 쉬운 유전자 적자 clone(s)의 성격을 결정할 수 있습니다. 여기, 비 코딩 DNA 영역 DARS2, 대장균의 염색체 복제의 개시를 제어 하는 예제로 사용 되었다. DARS2 의 기능 유전자 복제 관련 된 복용량;에 의해 영향을 받을 것으로 알려져 가까이 DARS2 는 더 활성화 된다 DNA 복제의 기원에 가져옵니다. DARS2 DARS2의 염색체에 무작위로 삽입 된-변형 삭제. 개별 삽입을 포함 하는 결과 클론 풀링된 그리고 세대의 수백을 위해 서로 경쟁 했다. 마지막으로, 적자 클론 특징 되었고 DARS2 원래 DARS2 위치에 가까운 근접에서 삽입 포함 발견.

남쪽 오 점 DARS2 transposon 라이브러리에 염색체에 걸쳐 무작위로 배포 했다 확인 이루어졌다 (t = 0) 적자 클론 시간이 지남에 유지할 것 이다 그. 남쪽 오 점 초기 transposon 풀에서 추출한 DNA에서 수행 되었다 (t = 0)과 경쟁 (그림 3)의 700 세대에서 모든 예상된 100. 여기, 각 시간 점에서 총 세포 DNA가 나 제한 효소, 잘라 transposon NKBOR 알려진 Pvu?...

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Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

여기, 비 코딩 DNA 요소의 transposon 중재 무작위 삽입의 힘의 최적의 염색체 위치를 해결 하기 위해 사용 되었다.

소설 Transposon 중재 방식을 사용 하 여 대장균 의 DNA 요소에 대 한 최적의 염색체 위치 결정

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

를 사용하여 주변 입자상 물질에 의한 염색체 수차 분석<em&gt; 체외</em&gt; 시스템

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

연구

유전학

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

DNA 콘텐츠 측정에 의한 포유 동물 복제 타이밍의 게놈 전체의 결정

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Phosphorothioates를 사용 하 여 RNA에서 사이트 바인딩 규제 단백질의 소설 포화 Mutagenesis 접근: 단일 단계 특성

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

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Excisable 항 생 저항 카세트와 P1 변환 하 여 대장균 에서 생산 유전자 삭제

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

작은 분자 조사를 시험관 및 셀 모양을 사용 하 여 사전 mRNA 구조 변화 유도

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Vivo 내 인 성 유전자 발현의 조작에 대 한 원격 제어 시스템의 응용 프로그램에서

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

질량 분석 기반 Proteomics 분석 소설 단백질을 공개할 OpenProt 데이터베이스를 사용 하 여 비 정식 열려있는 독서 프레임에서 번역

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

DNA 손상의 평가를 위한 혜성 분석에서 냉동 조직의 사용

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...