Name: determination of the optimal chromosomal location(s) for a dna element in escherichia coli using a novel transposon-mediated approach
Uploaded: 2017-09-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach at JoVE.com

Авторы были финансируемых за счет грантов из Ново Нордиск фонд, Фонд Lundbeck и датский национальный исследовательский фонд (DNRF120) через центр для бактериальных реакции на стресс и настойчивость (BASP).

1. Коллекция библиотеки Transposon Примечание: хромосомном локусе DARS2 был клонирован в мини-Tn 10-на основе transposon, NKBOR (на pNKBOR) 21, что приводит к NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR можно получить онлайн 22. pNKBOR — на основе R6K самоубийства вектор, который требует...

<ol>
	<li>Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+bacterial+chromosome+replication+by+non-coding+regions+outside+the+origin.">Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin.</a> Curr Genet. , (2016).</li><li>Sherratt, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+and+chromosome+segregation.">Recombination and chromosome segregation.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).</li><li>Bigot, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+motifs+that+control+E.+coli+chromosome+segregation+by+orienting+the+FtsK+translocase.">DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase.</a> EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).</li><li>Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Replication+Control+Is+Linked+to+Genomic+Positioning+of+Control+Regions+in+Escherichia+coli.">DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli.</a> PLoS Genet. 12 (9), 1006286 (2016).</li><li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA Replication, Second Edition. , (1992).</li><li>Kaguni, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+initiation+at+the+Escherichia+coli+chromosomal+origin.">Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin.</a> Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).</li><li>Leonard, A. C., Grimwade, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DnaA+assembly+and+activity:+taking+directions+from+the+genome.">Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome.</a> Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).</li><li>Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+cycle-coordinated+change+of+the+adenine+nucleotide-bound+forms+of+DnaA+protein+in+Escherichia+coli.">Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli.</a> EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).</li><li>Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+activates+dnaA+protein+in+initiating+replication+of+plasmids+bearing+the+origin+of+the+E.+coli+chromosome.">ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome.</a> Cell. 50 (2), 259-265 (1987).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).</li><li>Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeqA:+a+negative+modulator+of+replication+initiation+in+E.+coli.">SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli.</a> Cell. 77 (3), 413-426 (1994).</li><li>Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initiator+function+of+DnaA+protein+is+negatively+regulated+by+the+sliding+clamp+of+the+E.+coli+chromosomal+replicase.">The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase.</a> Cell. 94 (1), 61-71 (1998).</li><li>Kato, J., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hda,+a+novel+DnaA-related+protein,+regulates+the+replication+cycle+in+Escherichia+coli.">Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli.</a> EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).</li><li>Kasho, K., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaA+binding+locus+datA+promotes+DnaA-ATP+hydrolysis+to+enable+cell+cycle-coordinated+replication+initiation.">DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).</li><li>Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+control+of+replication+initiation+by+a+novel+chromosomal+locus+exhibiting+exceptional+affinity+for+Escherichia+coli+DnaA+protein.">Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein.</a> Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).</li><li>Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+genomic+sequences+of+E.+coli+promote+replicational+initiation+by+directly+reactivating+ADP-DnaA.">Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA.</a> Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).</li><li>Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timely+binding+of+IHF+and+Fis+to+DARS2+regulates+ATP-DnaA+production+and+replication+initiation.">Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation.</a> Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).</li><li>Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+regions+for+chromosome+replication+are+conserved+with+respect+to+sequence+and+location+among+Escherichia+coli+strains.">Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains.</a> Front Microbiol. 6, 1011 (2015).</li><li>Bergthorsson, U., Ochman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+chromosome+length+variation+in+natural+isolates+of+Escherichia+coli.">Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli.</a> Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).</li><li>Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+of+bacteria:+a+promising+tool+in+experimental+and+clinical+microbiology.">Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology.</a> J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).</li><li>Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NKBOR,+a+mini-Tn10-based+transposon+for+random+insertion+in+the+chromosome+of+Gram-negative+bacteria+and+the+rapid+recovery+of+sequences+flanking+the+insertion+sites+in+Escherichia+coli.">NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli.</a> Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).</li><li>Shafferman, A., Helinski, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+properties+of+the+beta+origin+of+replication+of+plasmid+R6K.">Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K.</a> J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).</li><li>Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+protocol+for+preparation+of+electrocompetent+Escherichia+coli+and+Vibrio+cholerae.">Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li><li>Smith, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Random+primed+labeling+of+DNA.">Random primed labeling of DNA.</a> Methods Mol Biol. 18, 445-447 (1993).</li><li>Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomal+replication+incompatibility+in+Dam+methyltransferase+deficient+Escherichia+coli+cells.">Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells.</a> EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).</li><li>Harrison, R. W., Miller, J. C., D'Souza, M. J., Kampo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Easy+gene+walking.">Easy gene walking.</a> Biotechniques. 22 (4), 650-653 (1997).</li><li>Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+local+alignment+search+tool.">Basic local alignment search tool.</a> J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).</li><li>Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+right+half+of+the+Escherichia+coli+replication+origin+is+not+essential+for+viability,+but+facilitates+multi-forked+replication.">The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication.</a> Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).</li><li>Lobner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+minichromosomes+in+individual+Escherichia+coli+cells:+implications+for+replication+control.">Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control.</a> EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).</li><li>Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DnaA+protein+determines+the+initiation+mass+of+Escherichia+coli+K-12.">The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12.</a> Cell. 57 (5), 881-889 (1989).</li><li>Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAPlotter:+circular+and+linear+interactive+genome+visualization.">DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization.</a> Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).</li><li>Eckert, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+application+of+transposon-directed+insertion+site+sequencing+to+a+library+of+signature-tagged+mini-Tn5Km2+mutants+of+Escherichia+coli+O157:H7+screened+in+cattle.">Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle.</a> J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).</li><li>van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tn-seq:+high-throughput+parallel+sequencing+for+fitness+and+genetic+interaction+studies+in+microorganisms.">Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms.</a> Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).</li><li>van Opijnen, T., Camilli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transposon+insertion+sequencing:+a+new+tool+for+systems-level+analysis+of+microorganisms.">Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).</li><li>Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+Adaptive+Laboratory+Evolution+of+Microorganisms+Using+a+Chemostat.">Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat.</a> J Vis Exp. (115), (2016).</li><li>Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+position+effects+on+gene+expression+in+Escherichia+coli+K-12.">Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12.</a> Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).</li><li>Blattner, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+complete+genome+sequence+of+Escherichia+coli+K-12.">The complete genome sequence of Escherichia coli K-12.</a> Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).</li></ol>

Методология, используемая здесь преимущества методов ответить трудный вопрос относительно оптимального геномной положение генетического элемента. Случайные вставки генетического элемента, (при посредничестве transposon) позволяет быстро и легко коллекция из тысяч клонов, которые затем ?...

Функцию любого генетического элемента могут быть затронуты его расположение в геноме. В бактерии это главным образом результатом вмешательства по транскрипции соседних генов, местные ДНК топологии или репликации связанных генов дозировка. В частности процесс репликации ДНК и сегрегации находятся под контролем, по крайней мере в части, некодирующих хромосомных регионов1и правильного функционирования этих регионов зависит геномной местоположение/контекста. В E.coli, примерами являются сайт НСВРС , необходимые для сестра хромосомы резолюции2; КОПС последовательности, необходимые для хромосома сегрегации3; данных, DARS1и DARS2 регионов, требуется для надлежащей репликации хромосомных управления (ниже; 4). Мы представляем метод, позволяющий для случайного перемещения, выбора и определения оптимального генетических контекста любого данного генетического элемента, здесь свидетельствует исследование некодирующих региона DARS2 .
В E. coli, DnaA отвечает инициатор белка для открытия на одной репликации происхожденияОричстренге дна и для найма helicase DnaB5,6,7. DnaA принадлежит к AAA+ (т.е., ATPases, связанные с различными мероприятиями) белки и можно привязать АТФ и АДФ с аналогичными высокой работоспособностью5. УровеньАТФ DnaA пики на начало8, где DnaAСПС образует multimer на Орич что вызывает ДНК дуплекс открытия9. После посвящения Орич производится механизм связывания белка SeqA, чтобы hemimethylated временно недоступен для повторного запуска из-за поглощения Орич10,11. Во время связывания, уровень DnaAАТФ снижается, по крайней мере два механизма: регулирования инактивации DnaA (RIDA)12,13 и данных-зависимых DnaAСПС гидролиз (DDAH)14 ,15. Рида и DDAH способствуют преобразование DnaAСПС DnaAADP. До нового раунда посвящения, DnaAADP повторную активацию с DnaAАТФ в специфических последовательностей реактивации DnaA (DARS): DARS1 и DARS216,17. Хромосомная данных, DARS1и DARS2 регионах некодирующих и действовать шаперонов как для модуляции DnaAАТФ/DnaAADP взаимное преобразование. Эти районы, расположенные за пределами происхождения репликации, чтобы Ассамблея DnaA комплекс либо инактивация (данные; 14) или активации (DARS1 и DARS2; 17) из DnaA. Удаление DARS2 в клетке не меняет массы удвоение время, но результаты асинхронной репликации начало15,16,18. Однако DARS2-дефицит клетки имеют фитнес стоимость по сравнению с иначе isogenic wildtype во время обоих непрерывного роста конкуренции в богатой среде или создания колонизации кишечника мыши18. Это означает, что даже незначительные изменения в концентрации асинхронности/происхождения имеют негативное воздействие на бактериальных фитнес. В E. coliсуществует селективного давления для поддержания хромосома симметрии (т.е. два почти одинаковой длины оружия репликации)19. Данных, DARS1и DARS2 регионы имеют же относительное расстояние до Орич всех E. coli штаммов виртуализированных18, несмотря на большие различия в размер хромосомы.
Здесь мы используем DARS2 региона кишечной палочки в качестве примера для выявления хромосомных положении(ях), оптимальный для его функции. DARS2 был вставлен в NKBOR transposon и результирующая NKBOR::DARS2 transposon, впоследствии вставлены случайно в геном MG1655 ΔDARS2. Таким образом, мы создали коллекцию ячеек, каждый обладающий DARS2 размещены в другом месте на хромосоме. В vitro конкуренции эксперимент, где все клетки в коллекции были объединены и соревновались друг с другом во время непрерывного роста в LB для примерно 700 поколений, была выполнена. Итоги конкурса эксперимента мониторинг/определялся с помощью Южная помарка, легко гена ходьбу и всего генома (РГ; Рисунок 1). Концевой клоны, решаются ходьба легко гена характеризовались проточной цитометрии для оценки параметров клеточного цикла. В анализе гранулярных потока размер ячейки, содержание ДНК и инициации синхронии может измеряться для большого числа клеток. При проточной цитометрии, поток одиночных клеток проходит луч света соответствующей длины волны для возбуждения окрашенных ДНК, которая затем одновременно зарегистрирована в photomultipliers, которые собирают испускаемого флуоресценции, мера содержания ДНК, условии клетки витражи для ДНК. Рассеянном свете является мерой массы клеток20.
В vitro конкуренции эксперимент, который мы представляем здесь используется для решения вопросов, касающихся важности хромосомных позиции и геномных контексте генетического элемента. Метод объективной и легко в использовании.

<table width="819">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Autoclaved Mili-Q water</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:119px;">None</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Electroporation Cuvettes, 0.1 cm</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P41050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Bio-Rad MicroPulser Electroporation System</td>
			<td style="width:164px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">LB Broth</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12780029&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">LB Agar, powder (Lennox L agar)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22700025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Glycerol</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Fisherbrand&#160;Plastic Petri Dishes</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S33580A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Nunc&#160;CryoTubes</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">V7634&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">dATP, [&#945;-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 &#181;Ci</td>
			<td style="width:164px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU012H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">DECAprime II DNA Labeling Kit</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM1455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Spectrophotometer&#160; SF/MBV/03.32</td>
			<td style="width:164px;">Pharmacia</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Hermle Centrifuge&#160;&#160;&#160; SF/MBV/03.46</td>
			<td style="width:164px;">Hermle</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Ole Dich Centrifuge&#160; SF/MBV/03.29</td>
			<td style="width:164px;">Ole Dich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Eppendorftubes 1.5 mL</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Eppendorftubes 2.0 mL</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T2795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">96% Ethanol</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">16368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Trizma HCl</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T-3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Phenol Ultra Pure</td>
			<td>BRL</td>
			<td>5509UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Ribonuclease A type II A</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Sodiumdodecylsulphate (SDS)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>13760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L 6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>405-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">0.5M Na-EDTA pH 8.0</td>
			<td>BRL</td>
			<td>5575 UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10106801001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">PvuI (10 U/&#181;L)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Tris-Borate-EDTA buffer</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">433160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Whatman&#160;3MM papers</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WHA3030931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">SSC Buffer 20&#215; Concentrate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Amersham Hybond-N+</td>
			<td style="width:164px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">RPN119B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Ficoll&#160;400</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Bovine Serum Albumin - Fraction V</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">85040C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Carestream Kodak &#160;BioMax &#160;light film</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z373494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">GenElute &#160;Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">NA1111&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">GenElute &#160;PCR Clean-Up Kit</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">NA1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">T100&#160; Thermal Cycler</td>
			<td style="width:164px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:164px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">34514.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Cephalexin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Mithramycin</td>
			<td style="width:164px;">Serva</td>
			<td>29803.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">246964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Apogee A10 instrument</td>
			<td style="width:164px;">Apogee</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the optimal chromosomal location(s) for a dna element in escherichia coli using a novel transposon-mediated approach

Оптимальной хромосомных позиции данного элемента ДНК была/были определены transposon опосредованной случайные вставки после отбора фитнес. В бактерии влияние генетических контекста на функции генетического элемента может быть трудно оценить. Ряд механизмов, включая топологических эффекты, транскрипционный анализ помехи от соседних генов, и/или репликации связанных генов дозировки, может повлиять на функции данного генетического элемента. Здесь мы описываем метод, который позволяет случайных интеграции элемента ДНК в хромосоме Escherichia coli и выберите наиболее благоприятных мест, с помощью простого роста конкуренции эксперимент. Этот метод принимает преимущество хорошо описано на базе transposon системы случайные вставки, в сочетании с выбором приспособленных clone(s) роста преимущество, процедура, которая легко регулируются для экспериментальной потребности. Характер приспособленных clone(s) может определяться всего генома на сложных мульти клоновых населения или легко гена, ходьба для быстрой идентификации отдельных клонов. Здесь без кодирования ДНК региона DARS2, которая контролирует инициации репликации хромосомы в E. coli, был использован в качестве примера. Функция DARS2 , как известно, быть затронуты дозировка репликации связанных генов; ближе DARS2 получает происхождения репликации ДНК, тем более активной становится. DARS2 случайно был вставлен в хромосоме DARS2-исключить деформации. Результирующая клоны, содержащие отдельные вставки были объединены и соревновались друг с другом для сотни поколений. Наконец приспособленных клоны были характерны и содержит DARS2 вставлены в непосредственной близости от первоначального места DARS2 .

Южная помарка было сделано, чтобы убедиться, что DARS2 был распространен случайным образом хромосомы в библиотеке transposon (t = 0) и что со временем будет сохраняться приспособленных клонов. Южная помарка была выполнена на ДНК, извлеченные из первоначального transposon бассе?...

Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach at JoVE.com

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Здесь мощность transposon опосредованной случайные вставки элемента-кодирования ДНК использовался для разрешения его оптимального хромосомные положения.

Определение оптимального расположения хромосомных ДНК элемента в Escherichia coli с помощью Роман Transposon опосредованный подход

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Анализ окружающей среды твердые частицы-индуцированных хромосомных аберраций Использование номера<em&gt; In Vitro</em&gt; система

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Генома Определение МЛЕКОПИТАЮЩИХ репликации ДНК с помощью Timing Content измерения

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Надежные ДНК изоляции и высокопроизводительного секвенирования строительство библиотеки для образцов гербария

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Роман насыщения мутагенеза подхода: Один шаг характеристика регламентационный протеин привязки сайтов в РНК с помощью кислота

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Производство гена удалений в Escherichia coli , P1 трансдукция с подакцизных антибиотикорезистентности кассеты

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Использование в пробирке и в клеток форму расследовать малые молекулы индуцированной пре мРНК структурные изменения

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

В естественных условиях применение системы дистанционного управления для манипуляции эндогенного экспрессии генов

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Масса на основе спектрометрии протеомики анализа с использованием базы данных OpenProt откроет новые белки перевод с неканоническим открытом чтения фреймов

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

Использование замороженных тканей в ассе кометы для оценки повреждения ДНК

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...