Name: determination of the optimal chromosomal location(s) for a dna element in escherichia coli using a novel transposon-mediated approach
Uploaded: 2017-09-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach at JoVE.com

Los autores fueron financiados por subvenciones de la Fundación de Novo Nordisk, la Fundación Lundbeck y la Fundación Nacional de investigación danés (DNRF120) a través del centro de respuesta bacteriana al estrés y persistencia (BASP).

1. colección de la biblioteca del Transposon Nota: el locus cromosómico de DARS2 fue clonado en la mini Tn 10-basado transposon, NKBOR (en pNKBOR) 21, resultando en NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR pueden obtenerse en línea 22. pNKBOR es un vector basado en R6K suicida que requiere el π de la proteína del iniciador para replicación 23. Plásmido pJFM1 por lo tanto es capaz de replicar en un...

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	<li>Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+bacterial+chromosome+replication+by+non-coding+regions+outside+the+origin.">Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin.</a> Curr Genet. , (2016).</li><li>Sherratt, D. 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A., Lobner-Olesen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Replication+Control+Is+Linked+to+Genomic+Positioning+of+Control+Regions+in+Escherichia+coli.">DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli.</a> PLoS Genet. 12 (9), 1006286 (2016).</li><li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> DNA Replication, Second Edition. , (1992).</li><li>Kaguni, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+initiation+at+the+Escherichia+coli+chromosomal+origin.">Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin.</a> Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).</li><li>Leonard, A. C., Grimwade, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+DnaA+assembly+and+activity:+taking+directions+from+the+genome.">Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome.</a> Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).</li><li>Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+cycle-coordinated+change+of+the+adenine+nucleotide-bound+forms+of+DnaA+protein+in+Escherichia+coli.">Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli.</a> EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).</li><li>Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP+activates+dnaA+protein+in+initiating+replication+of+plasmids+bearing+the+origin+of+the+E.+coli+chromosome.">ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome.</a> Cell. 50 (2), 259-265 (1987).</li><li>Brendler, T., Austin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+SeqA+protein+to+DNA+requires+interaction+between+two+or+more+complexes+bound+to+separate+hemimethylated+GATC+sequences.">Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences.</a> EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).</li><li>Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeqA:+a+negative+modulator+of+replication+initiation+in+E.+coli.">SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli.</a> Cell. 77 (3), 413-426 (1994).</li><li>Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initiator+function+of+DnaA+protein+is+negatively+regulated+by+the+sliding+clamp+of+the+E.+coli+chromosomal+replicase.">The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase.</a> Cell. 94 (1), 61-71 (1998).</li><li>Kato, J., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hda,+a+novel+DnaA-related+protein,+regulates+the+replication+cycle+in+Escherichia+coli.">Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli.</a> EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).</li><li>Kasho, K., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaA+binding+locus+datA+promotes+DnaA-ATP+hydrolysis+to+enable+cell+cycle-coordinated+replication+initiation.">DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).</li><li>Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+control+of+replication+initiation+by+a+novel+chromosomal+locus+exhibiting+exceptional+affinity+for+Escherichia+coli+DnaA+protein.">Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein.</a> Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).</li><li>Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+genomic+sequences+of+E.+coli+promote+replicational+initiation+by+directly+reactivating+ADP-DnaA.">Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA.</a> Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).</li><li>Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timely+binding+of+IHF+and+Fis+to+DARS2+regulates+ATP-DnaA+production+and+replication+initiation.">Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation.</a> Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).</li><li>Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+properties+of+the+beta+origin+of+replication+of+plasmid+R6K.">Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K.</a> J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).</li><li>Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+protocol+for+preparation+of+electrocompetent+Escherichia+coli+and+Vibrio+cholerae.">Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae.</a> J Vis Exp. (80), (2013).</li><li>Smith, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+gapped-read+alignment+with+Bowtie+2.">Fast gapped-read alignment with Bowtie 2.</a> Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).</li><li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. 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G., von Meyenburg, K., Boye, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DnaA+protein+determines+the+initiation+mass+of+Escherichia+coli+K-12.">The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12.</a> Cell. 57 (5), 881-889 (1989).</li><li>Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNAPlotter:+circular+and+linear+interactive+genome+visualization.">DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization.</a> Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).</li><li>Eckert, S. 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La metodología utilizada aquí toma ventaja de las técnicas de vanguardia para responder a una pregunta difícil con respecto a la posición óptima de genomic de un elemento genético. La inserción al azar del elemento genético (mediada por el transposon) permite la fácil y rápida recopilación de miles de clones, que luego se pueden hacer para competir entre sí para seleccionar la posición óptima del elemento genético investigado (es decir, el clon más apto).
Aquí, D...

La función de cualquier elemento genético puede verse afectada por su localización en el genoma. En las bacterias, esto resulta fundamentalmente de interferencia por la transcripción de genes vecinos, local topología de ADN o dosis de gen asociado de replicación. En particular, los procesos de replicación del DNA y la segregación son controlados, al menos en parte, por las regiones cromosómicas no codificante1y el funcionamiento de estas regiones depende de situación/contexto genómico. En e. coli, los ejemplos son el sitio de dif , necesario para la hermana de resolución del cromosoma2; Secuencias KOPS, necesarias para de la segregación del cromosoma3; datos, DARS1y DARS2 regiones, requeridas para el control de la replicación cromosómica adecuada (abajo; 4). se presenta un método que permite la reubicación al azar, la selección y la determinación del contexto genético óptimo de cualquier elemento genético, ejemplificados aquí por el estudio de la región no codificante de DARS2 .
En e. coli, DnaA es la proteína del iniciador responsable de filamento de la DNA en la replicación solo origenoriCy para la contratación de la helicasa DnaB5,6,7. DnaA pertenece a la AAA+ (es decir, asociados a diversas actividades de ATPasas) proteínas y puede enlazar ATP y ADP con similar alta afinidad5. El nivel de DnaAATP picos en iniciación8, donde DnaAATP forma un multimer en oriC que activa el ADN dúplex apertura9. Después de la iniciación, oriC se hace disponible para la iniciación debido a secuestro por un mecanismo que implica el atascamiento de la proteína SeqA hemimethylated oriC10,11. Durante el secuestro, se reduce el nivel de DnaAATP por al menos dos mecanismos: la regulación inactivación de DnaA (RIDA)12,13 y datos-DnaA dependienteATP hidrólisis (DDAH)14 ,15. RIDA y DDAH promoción la conversión de DnaAATP aADPde DnaA. Antes de una nueva ronda de iniciación, DnaAADP se reactiva a DnaAATP en secuencias específicas de reactivación de DnaA (DARS): DARS1 y DARS216,17. La cromosómica datos, DARS1y DARS2 regiones son no codificante y actuar de una manera como acompañante para modular DnaAATPADP interconversión de /DnaA. Estas regiones, las afueras del origen de replicación, que al montaje de un complejo de DnaA para cualquiera la inactivación (datos; 14) o activación (DARS1 y DARS2; 17) de DnaA. Eliminación de DARS2 en una celda no altera masa doblar tiempo pero resulta en replicación asincrónica iniciación15,16,18. Sin embargo, DARS2-células deficientes tienen un gimnasio costo comparado con un tipo de salvaje lo contrario isogénicas durante ambos competencia de continuo crecimiento en medio rico o en el establecimiento de la colonización en el intestino de ratón18. Esto indica que incluso pequeños cambios en la concentración de asincronía/origen tienen un efecto negativo en fitness bacteriano. En e. coli, hay una presión selectiva para mantener la simetría (es decir, dos brazos de la replicación de casi igual longitud) de cromosoma19. Los datos, DARS1y DARS2 regiones tienen la misma distancia relativa a oriC en todo e. coli cepas secuenciadas18, a pesar de grandes variaciones en el tamaño del cromosoma.
Aquí, utilizamos la región DARS2 de e. coli como ejemplo para la identificación de los puestos cromosómicas óptimos para su función. DARS2 fue insertado en el transposon NKBOR y la resultante NKBOR:: transposonDARS2 posteriormente se inserta al azar en el genoma de MG1655 ΔDARS2. Así generó una colección de células, cada posesión DARS2 colocado en un lugar diferente en el cromosoma. Se realizó un en vitro competencia experimento, donde todas las células de la colección fueron agrupadas y compitieron entre sí durante el crecimiento continuo en libras para un estimado generaciones 700. El resultado del experimento de competencia monitoreados/determinó mediante Southern blot, gene fácil caminar y secuenciación del genoma completo (gt; Figura 1). Clones de punto final resueltas por gene fácil caminar se caracterizaron por citometría de flujo para evaluar los parámetros de ciclo celular. En un análisis cytometric del flujo, tamaño de celda, el contenido de ADN y sincronía de iniciación se pueden medir para un gran número de células. En citometría de flujo, un flujo de células pasa un haz de luz de la longitud de onda adecuada para excitar el ADN teñido, que entonces está simultáneamente registrado por photomultipliers que recogen la fluorescencia emitida, una medida de contenido de ADN, siempre la las células se tiñen para ADN. La luz dispersada hacia adelante es una medida de masa celular20.
El experimento de competencia en vitro que presentamos aquí se utiliza para abordar las cuestiones relativas a la importancia de la posición cromosómica y el contexto genómico del elemento genético. El método es fácil de usar e imparcial.

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	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Autoclaved Mili-Q water</td>
			<td style="width:164px;"></td>
			<td style="width:119px;">None</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Electroporation Cuvettes, 0.1 cm</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P41050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Bio-Rad MicroPulser Electroporation System</td>
			<td style="width:164px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">LB Broth</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12780029&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">LB Agar, powder (Lennox L agar)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22700025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Glycerol</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">17904</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Fisherbrand&#160;Plastic Petri Dishes</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S33580A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-432-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:164px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Nunc&#160;CryoTubes</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">V7634&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/&#181;L)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">F530S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">dATP, [&#945;-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 &#181;Ci</td>
			<td style="width:164px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU012H250UC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">DECAprime II DNA Labeling Kit</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">AM1455</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:369px;height:20px;">Spectrophotometer&#160; SF/MBV/03.32</td>
			<td style="width:164px;">Pharmacia</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Hermle Centrifuge&#160;&#160;&#160; SF/MBV/03.46</td>
			<td style="width:164px;">Hermle</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Ole Dich Centrifuge&#160; SF/MBV/03.29</td>
			<td style="width:164px;">Ole Dich</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Eppendorftubes 1.5 mL</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Eppendorftubes 2.0 mL</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T2795</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>6404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">96% Ethanol</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">16368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Trizma HCl</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T-3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Phenol Ultra Pure</td>
			<td>BRL</td>
			<td>5509UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Merck</td>
			<td>2445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Ribonuclease A type II A</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Sodiumdodecylsulphate (SDS)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>13760</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Lysozyme</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>L 6876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>405-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">0.5M Na-EDTA pH 8.0</td>
			<td>BRL</td>
			<td>5575 UA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Kanamycin sulfate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10106801001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">PvuI (10 U/&#181;L)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ER0621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">16500500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:369px;height:42px;">DNA Gel Loading Dye (6X)</td>
			<td style="width:164px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">R0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Tris-Borate-EDTA buffer</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T4415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Ethidium bromide</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7637</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">433160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Sodium Hydroxide</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Whatman&#160;3MM papers</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">WHA3030931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">SSC Buffer 20&#215; Concentrate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S6639</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Amersham Hybond-N+</td>
			<td style="width:164px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">RPN119B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Ficoll&#160;400</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">PVP40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Bovine Serum Albumin - Fraction V</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">85040C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Carestream Kodak &#160;BioMax &#160;light film</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z373494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">GenElute &#160;Gel Extraction Kit</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">NA1111&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">GenElute &#160;PCR Clean-Up Kit</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">NA1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">T100&#160; Thermal Cycler</td>
			<td style="width:164px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">SmartSpec Plus Spectrophotometer</td>
			<td style="width:164px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Rifampicin</td>
			<td style="width:164px;">Serva</td>
			<td style="width:119px;">34514.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Cephalexin</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4895</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Mithramycin</td>
			<td style="width:164px;">Serva</td>
			<td>29803.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td style="width:164px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">246964</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:369px;height:21px;">Apogee A10 instrument</td>
			<td style="width:164px;">Apogee</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of the optimal chromosomal location(s) for a dna element in escherichia coli using a novel transposon-mediated approach

La posición o posiciones cromosómica óptima de un determinado elemento de ADN fue/fueron determinada por la inserción al azar mediada por transposones, seguido por la selección de fitness. En bacterias, el impacto del contexto genético de la función de un elemento genético puede ser difícil de evaluar. Varios mecanismos, incluyendo efectos topológicos, interferencia transcripcional de genes vecinos, o dosis de gen asociado de replicación, pueden afectar la función de un elemento genético. Aquí, describimos un método que permite la integración al azar de un elemento de DNA en el cromosoma de Escherichia coli y seleccionar las ubicaciones más favorables mediante una competencia de crecimiento simple experimentan. El método aprovecha de un bien-descrito transposones-sistema de inserción al azar, juntada con una selección de los más aptos clone(s) ventaja del crecimiento, un procedimiento que es fácilmente ajustable a las necesidades experimentales. Puede determinarse la naturaleza de la clone(s) más aptos por todo el genoma que ordenaba en una población clonal múltiples compleja o por gene fácil para la identificación rápida de clones seleccionados. Aquí, la región no codificante de ADN DARS2, que controla la iniciación de la replicación del cromosoma de e. coli, fue utilizada como ejemplo. La función de DARS2 es conocida por ser afectados por dosis de gen asociado de replicación; el más DARS2 obtiene el origen de replicación del ADN, más activo se convierte. DARS2 fue insertado al azar en el cromosoma de un DARS2-elimina la tensión. Los clones resultantes que contienen inserciones individuales se agruparon y compitieron entre sí a cientos de generaciones. Finalmente, los clones más aptos se caracteriza y contiene DARS2 en proximidad cercana a la ubicación original de DARS2 .

Una mancha blanca /negra meridional fue hecha para verificar que DARS2 se distribuyó al azar a lo largo del cromosoma en la biblioteca de transposon (t = 0) y que los clones más aptos persistiría en el tiempo. El Southern blot fue realizada en la DNA extraída de la piscina de transposon inicial (en t = 0) y cada 100 estimado de 700 generaciones de competencia (figura 3). Aquí, la DNA celular total de cada punto del tiempo fue digerido con Pv...

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Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Aquí, el poder de una inserción al azar de un elemento de DNA no codificante mediada por transposones se utilizó para resolver su posición cromosómica óptima.

Determinación de la óptima Localización cromosómica de un elemento de DNA en Escherichia coli utilizando un nuevo enfoque mediada por transposones

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Research

JoVE Journal

Genetics

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

El análisis de la inducida por la materia particulada ambiental aberraciones cromosómicas El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Sistema

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

Investigación

Genética

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detección del número de copias alteraciones Uso de Secuenciación de los organismos unicelulares

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement

Determinación de todo el genoma de los mamíferos sincronización de replicación de ADN por medición del contenido

Replication of the genome occurs during S phase of the cell cycle in a highly regulated process that ensures the fidelity of DNA duplication. Each genomic ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robusto de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Un enfoque de mutagénesis de saturación novela: Solo paso caracterización de sitios en el ARN usando fosforotioatos de unión de proteína reguladora

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Producción de canceladuras del Gene en Escherichia coli por transducción de P1 con casetes de resistencia a los antibióticos

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

Uso en Vitro y en las células la forma para investigar la molécula pequeña inducida por cambios estructurales Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

Aplicación in vivo del sistema de control remoto para la manipulación de genes endógenos

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Análisis de proteómica basada en espectrometría de masa usando la base de datos OpenProt para develar nuevas proteínas traducción de marcos de lectura abierto no-canónico

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

Use of Frozen Tissue in the Comet Assay for the Evaluation of DNA Damage

Uso de tejido congelado en el ensayo de cometas para la evaluación del daño causado por el ADN

The comet assay is gaining popularity as a means to assess DNA damage in cultured cells and tissues, particularly following exposure to chemicals or other ...