Name: microfluidic bioprinting for engineering vascularized tissues and organoids
Uploaded: 2017-08-11T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids at JoVE.com

המחברים להכיר המכון הלאומי לסרטן של מוסדות לאומיים של בריאות מסלול העצמאות פרס (K99CA201603).

Cardiomyocytes עכברוש neonatal בשימוש פרוטוקול זה הם בודדו אותנו מהמתרחש חולדות ספראג-Dawley בן יום-2 בעקבות הליך ומבוססת56 אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועד לשימוש בריגהם אנד וימנס.
1. אינסטרומנטציה של Bioprinter
<ol>
	<li>להוסיף מחט בוטה קטנים יותר (למשל, 27 גרם, 1 אינץ ') כמ?...

בניית ראש ההדפסה co-צירית מייצג צעד קריטי לקראת bioprinting microfluidic מוצלח כדי לאפשר משלוח בו זמנית של שתי bioink הליבה והסוכנת crosslinking מהנדן. בעוד פרוטוקול זה ראש ההדפסה דוגמה נוצר באמצעות מחט 27G וגם הליבה של מחט 18 גרם כמו המעטפת, זה ברצון יורחב למגוון רחב של שילובים באמצעות מחטים בגדלים שונים. עם זאת, ?...

. מטרות הנדסת רקמות כדי ליצור תחליפי רקמה תפקודית זה יכול לשמש כדי להחליף, לשחזר או להגדיל האלה פצוע או חולה גוף האדם1,2,3,4, לעיתים קרובות באמצעות שילוב של סוגי התאים הרצויים, מולקולות ביו5,6ו-9,8,7,biomaterials10 לאחרונה, טכנולוגיות הנדסת רקמות גם יותר ויותר שאומצו ליצירת במבחנה רקמות איברים דגמים המחקים את פונקציות חשובות של מקביליהם ויוו , עבור יישומים כגון פיתוח תרופות, החלפת קונבנציונאלי תא מישורי יתר מפושטת תרבויות11,12,13,14,15,16,17,18,19. בשני המצבים, יכולת לסכם את המיקרו-ארכיטקטורה מורכבת ואת המבנה ההירארכי של רקמות אנושיות הוא קריטי הפעלת פונקציונליות של רקמות מהונדסים10, בפרט, דרכים לשלב רשת כלי הדם לתוך רקמות מהונדסים הביקוש מאז vascularization מציג את אחד האתגרים הגדולים ביותר עד22,2321,20,שדה.
עד כה, מגוון רחב של גישות פותחו בהקשר זה, בניסיון לבנות מבנים כלי דם לתוך רקמות מהונדסים בונה עם דרגות שונות של הצלחה8. לדוגמה, הרכבה עצמית של תאי אנדותל מאפשר לדור של רשתות microvascular24; משלוח של גורמי גדילה אנגיוגנזה המניע מתמשכת כורוידאלית25,26; שימוש ובתאים וסקולרית ומקל pericytes תא אנדותל הצמיחה ואת מכלול24,27; עיצוב מאפיינים לגרדום מאפשר אפנון מדויק של28,vascularization29; תא גליון הטכנולוגיה מאפשרת תמרון נוח של כלי הדם בשכבות30. ובכל זאת, אסטרטגיות אלו לא להעניק את יכולת השליטה של המתבנת המרחבי של להערכת, המוביל לעיתים קרובות הפצה אקראית של כלי דם בתוך מבנה רקמות מהונדסים ובכך הפארמצבטית מוגבלת. במהלך השנים האחרונות התפתחה bioprinting מחלקה של הפעלת טכנולוגיות לקראת הפתרון של אתגר כזה, בשל שלהם צדדיות ללא תחרות של הפקדת רקמות מורכבות דפוסי דיוק גבוה, הפארמצבטית ב32,31,33צורה אוטומטית או חצי אוטומטית. Bioprinting ההקרבה34,35,36,37,38, bioprinting מוטבע-39,-40,-41, מבנה חלול bioprinting/biofabrication42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53 יש כל מה הפגינו את הכדאיות של יצירת רקמות לכלי הדם או vascularized.
לחלופין, אסטרטגיה bioprinting microfluidic לפברק פיגומים microfibrous פותחו לאחרונה, bioink היברידית המורכב alginate ואיפה ג'לטין methacryloyl (GelMA) הועבר דרך הליבה של אביזרים קונצנטריים פתרון סידן כלורי (2CaCl) בוצעה דרך הזרימה נדן החיצוני של54,ראש ההדפסה55. ההבלטה שיתוף של תזרימי שני המותר עבור crosslinking הפיזית המיידית של הרכיב alginate כדי לאפשר היווצרות מיקרופייבר, בעוד photocrosslinking הבאים הבטיחו קבוע ייצוב לגרדום microfibrous רב-שכבתית. ראוי לציין, תאי אנדותל אנקפסולציה בתוך הסיבים bioprinted נמצאו להתרבות ולהעביר לכיוון פריפריה של הסיבים בהנחה מבנים דמויי-לומן, זה ממש מחקה את המיטה וסקולרית54,55. Bioprinted אלו, endothelialized מיטות נימי הדם יכול להיות לאחר מכן מאוכלס עם הצורך סוגי תאים משנית נוספת לבנות רקמות vascularized55. פרוטוקול זה ובכך מספק הליך מפורט של כזה microfluidic bioprinting אסטרטגיה מופעלת על ידי עיצוב קונצנטריים זרבובית, המבטיח נוח פבריקציה נוספת של רקמות vascularized עבור יישומים פוטנציאליים הנדסת רקמות והן תא צורב דוגמנות.

<table width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">Alginic acid sodium salt from brown algae</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">A0682</td>
			<td style="width:480px;">BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">Gelatin type A from porcine skin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">G2500</td>
			<td>Gel strength 300</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:467px;height:42px;">Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4&#39;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">410896</td>
			<td>98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">HEPES buffer</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">H0887</td>
			<td>1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:467px;height:42px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">10438026</td>
			<td>Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">C5080</td>
			<td>BioXtra, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:467px;height:42px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">10010023</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">Human umbilical vein endothelial cells</td>
			<td style="width:160px;">Angio-Proteomie</td>
			<td style="width:163px;">cAP-0001</td>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells</td>
			<td style="width:160px;">Angio-Proteomie</td>
			<td style="width:163px;">cAP-0001GFP</td>
			<td>GFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">Endothelial cell growth medium</td>
			<td style="width:160px;">Lonza</td>
			<td style="width:163px;">CC-3162</td>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:467px;height:42px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">12430054</td>
			<td>High glucose, HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:467px;height:42px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:160px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:163px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>Clear 0.5 kg Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">UV curing lamp system</td>
			<td style="width:160px;">Excelitas Technologies</td>
			<td style="width:163px;">OmniCure S2000</td>
			<td>Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic bioprinting for engineering vascularized tissues and organoids

הנדסת רקמות vascularized בונה, organoids היה מאתגר מבחינה היסטורית. כאן אנו מתארים שיטה המבוססת על microfluidic bioprinting כדי להפיק לפיגום עם multilayer השזירה הידרוג הסיבים. כדי להשיג חלקים bioprinting, ראש ההדפסה microfluidic הליבה-נדן המכיל ניסוח bioink ללא הפרדות צבע extruded מן הזרם הליבה והפתרון crosslinking נישא על ידי הזרם נדן, היה מתוכנן ולהכניסם אל bioprinter. על ידי מיזוג ג'לטין methacryloyl (GelMA) עם קילוף פלסטיצידיות, רב-סוכר זה עובר מיידי crosslinking יוניים רכוש בחר יונים כלט, ואחריו photocrosslinking משנית של הרכיב GelMA כדי להשיג מייצב קבוע, לפיגום microfibrous יכולה להיות מושגת באמצעות אסטרטגיה זו bioprinting. חשוב לציין, תאי אנדותל אנקפסולציה בתוך הסיבים bioprinted יכולים ליצור את לומן-מבני הדומה את להערכת במרוצת של תרבות במשך 16 ימים. לגרדום endothelialized microfibrous ניתן להשתמש בהמשך כדי לבנות רקמה vascularized דרך זריעה עוקבות של סוג משני תאים לתוך מרחב ביניים של הסיבים כמו מצע כלי הדם. Microfluidic bioprinting מספקת אסטרטגיה כללית בהנדסה נוח של רקמות vascularized-דיוק גבוה.

האסטרטגיה bioprinting microfluidic מאפשר bioprinting ישירה ההבלטה של פיגומים microfibrous באמצעות צמיגות נמוכה bioinks54,55. כפי שמוצג באיור 2א, לפיגום בגודל של 6 × 6 × 6 מ מ3 המכיל &#62; 30 שכבות של הסיבים יכול להיות bioprinted בתוך 10 דקות. Crosslinking י...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids at JoVE.com

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

אנו מספקים פרוטוקול מוכללת המבוסס על אסטרטגיה bioprinting microfluidic הנדסה מיטה microfibrous בכלי הדם, שבו סוג התא משני יכול להיות עוד יותר נזרע לתוך מרחב ביניים של מבנה זה microfibrous ליצירת רקמות vascularized ו- organoids.

Vascularized Microfluidic Bioprinting עבור הנדסת רקמות, Organoids

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

The overall goal of this microfluidic bioprinting methodology, is to generate a vascularized tissue construct. This method can solve key questions in biofabrication of vascularized tissues. The main advantage of this technique is that it is versatile in generating a three dimensional shape controlled vascular vat for engineering vascularized tissues through a secondary cell seeding process.Though this protocol provides insight into engineering vascularized cardiac tissues, it can also be applied to many other tissue types such as liver, skin, and even cancers. General individuals new to this method may struggle because setting up the bioprinter may not be simple. To start this procedure, construct a dual layer concentric microfluidic print head by inserting a smaller blunt needle, serving as the core, into the center of the larger blunt needle, serving as the sheath.Make sure that the core needle is protruding from the outer shell approximately one millimeter. After that insert a 23 gauge needle in the barrel of the central needle in the reverse direction. Make a hole on the side of the barrel of the outer needle and insert a matching size metal connector.Seal with epoxy glue. Mount the extruder onto the head of a bioprinter, using a polymethyl methacrylate or PMMA holder. Next for injection of the bioink and the crosslinking solution through two PVC tubes individually, connect the inlets of the print head to a dual channel syringe pump.Make the bioink using a mixture of alginate, gelMA, and photoinitiator. Dissolved in 25 millimolar HEPES buffer, containing 10%fetal bovine serum or FBS. Then make a solution of 0.3 molar calcium chloride in HEPES buffer containing 10%FBS to serve as the crosslinking carrier fluid.Right before bioprinting, trypsinize human umbilical vein endothelial cells or HUVECs for five to 10 minutes. Centrifuge the cells at 800 RPM for five minutes in a 15 milliliter tube. Resuspend the cells in the bioink at a concentration of five to 10 times 10 to the six cells per milliliter by slowly pipetting five to 10 times.Next use a dual channel syringe pump to start the injection of the HUVECs laiden bioink through one, and the crosslinking fluid through the other channel at a flow rate of five microliters per minute. Allow the flows to continuously run for up to one minute until they stabilize. After that start the print head movement by maintaining the bioprinter deposition speed of approximately four millimeters per second.This bioprinting should result in fast ionic gelation of the alginate component and deposition of a microfiber scaffold. After the scaffold has been printed, photo crosslink the gelMA component with five to 10 milliwatts per square centimeter of UV light for 20 to 30 seconds to accomplish chemical gelation. Then remove the excess calcium chloride from the scaffold by gently rinsing it with 37 degrees Celsius warm PBS.Culture this scaffold in endothelial cell growth medium at 37 degrees Celsius in five volume percent CO2, for up to 16 days. Change the medium at least every two days. During the culture period, monitor the HUVECs under a microscope until they migrate to the peripheries of the scaffold microfibers and form lumen like structures.Then carefully remove the entire medium from the intrastitial space of the scaffold with capillary force using a piece of sterile filter paper. Instantly add a drop of suspension of a secondary cell type such as cardiomyocytes on top of the scaffold, allowing the cells to infiltrate the entire intrastitial space. After that incubate this scaffold in an incubator for 30 minutes to two hours, allowing the cells to adhere onto the individual microfibers.Remove non adherent cells by gently washing the scaffold with PBS. Culture this scaffold in appropriate medium until the desired vascularized tissue is formed. Microfluidic bioprinting described here, allows for direct bioprinting of microfibrous scaffolds using low viscosity bioinks.A scaffold that is six by six by six square millimeters in size<containing more than 30 microfibers, could be bioprinted within 10 minutes. Top, and side views of scaffold micrographs show the excellent structural integrity during the bioprinting process. Achieved with the immediate ionic crosslinking of the alginate component with calcium chloride.After microfluidic extrusion of the bioink, ionic crosslinking and photo crosslinking, HUVECs maintained a relatively high viability. The cells proliferated and migrated from the initially random distribution at day zero, to the peripheries of the microfibers at day 16. Neonatal rat cardiomyocytes that were seeded on the scaffold matured and populated the scaffold.They showed strong expression of functional cardiac biomarkers. Such as sarcomeric alpha actinin, and connexin 43. Confocal microscopy of a bioprinted microfibrous scaffold, populated with cardiomyocytes, revealed coexistence of both HUVECs and cardiomyocytes.HUVECs are mainly present in the boundaries of the mircofibers, whereas the cardiomyocytes surround the exterior of the microfibers. The cells were able to maintain their spontaneous and synchronized beating for up to nine to 28 days. Depending on the cell source and configuration of the scaffolds.After watching this video you should have a good understanding of how to produce vascularized tissues using the microfluidic bioprinting technique as well as print head fabrication and bioprinter operations. Visual demonstration of this method is critical as the fabrication of the print head and the operations of the bioprinter may be tricky for people who have not used one before. While attempting this procedure, it is important to remember to make the two needles concentric in the print head and let the flow stabilize prior to starting the bioprinting.With the development of this technique researchers in the field of tissue engineering and biofabrication now have another enabling tool to generate vascularized tissue constructs for either regeneration purposes in vivo or for modeling tissues in vitro.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

מערבלים microfluidic ללימוד קיפול חלבונים

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

ייצור מיקרופלואידי של סיבים פולימריים וביוהיברידים עם גודל וצורה מעוצבים מראש

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Electrospun סיבי פיגומים של פולי (גליצרול-dodecanedioate) להנדסה עצבית רקמות מתאי גזע עובריים בעכבר

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Microfluidic מאגר Exchange להנדסת תאים ללא התערבות מיקרו / Nanoparticle

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

טכניקת Dispensing רובוטיות אוטומטית להכוון משטחים Bioprinting של תאים

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

The Arteriovenous AV Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

Arteriovenous (AV) Loop במודל בעלי חיים קטנים לחקר אנגיוגנזה והנדסת רקמות כלי דם

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting של הסחוס, תחליפי רקמת העור ניצול פסיבים הרומן ערבוב טכניקה יחידה עבור Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

שתי שיטות Decellularization של רקמות הצמח ליישומים הנדסת רקמות

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...