Name: measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions at JoVE.com

R. W. H. V blev støttet af McGill naturvidenskab og teknisk forskning Rådet i Canada (NSERC) uddannelsesprogram i Bionanomachines. A. K. M. og P. E. J. blev støttet af NSERC tilskud 327028-09 (A. K. M) og 238562 (P. E. J.).

1. Prøvetilberedning
<ol><li>Rense ønskede biomolekyle13. Bemærk: Denne protokol bruger købte kokain-bindende DNA aptamer MN4 efter at have udvekslet mod 2 M NaCl tre gange efterfulgt af tre runder af deioniseret vand ved hjælp af en centrifugal filter med en 3 kDa molekylvægt cut-off membran.</li>
	<li>Syntetisere og rense, eller købe den ønskede termolabile ligand13. Bemærk: MN4 binder termolabile ligand kokain. MN4 binder også kinin, der bruges som en n...

<ol>
	<li>Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+in+life+science:+thermodynamics,+stability,+molecular+recognition+and+application+in+drug+design.">Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.</a> Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).</li><li>Privalov, P. L., Dragan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetry+of+biological+macromolecules.">Microcalorimetry of biological macromolecules.</a> Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).</li><li>Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+strong+to+ultratight+protein+interactions+using+differential+scanning+calorimetry.">Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry.</a> Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).</li><li>Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+characterization+of+folding+and+binding+interactions+with+thermolabile+ligands+by+DSC.">Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC.</a> Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).</li><li>Garbett, N. C., Chaires, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+studies+for+drug+design+and+screening.">Thermodynamic studies for drug design and screening.</a> Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).</li><li>Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+binding+thermodynamics+in+drug+discovery.">Measurements of binding thermodynamics in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).</li><li>Plotnikov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions.">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li><li>Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics-based+drug+design:+strategies+for+inhibiting+protein-protein+interactions.">Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions.</a> Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).</li><li>Peri&#225;nez Parraga, L., G-L, A., Gam&#243;n Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado S&#225;nchez, O., Puigvent&#243;s Latorre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolabile+Drugs.+Operating+Procedure+In+the+Event+of+Cold+Chain+Failure.">Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure.</a> Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).</li><li>Murray, J. B., Alshora, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+Cocaine+in+Aqueous-Solution.">Stability of Cocaine in Aqueous-Solution.</a> J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).</li><li>Waterman, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+in+pharmaceutical+formulations.">Hydrolysis in pharmaceutical formulations.</a> Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).</li><li>Mergny, J. L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thermal+melting+curves.">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li><li>Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+a+stem+length-dependent+binding+mechanism+for+the+cocaine-binding+aptamer.+A+combined+NMR+and+calorimetry+study.">Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study.</a> Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).</li><li>Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+electrophoretic+and+hydrodynamic+properties+of+DNA+and+RNA+oligonucleotide+duplexes.">Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes.</a> Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).</li><li>Durchschlag, H., Hinz, H. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , 45-128 (1986).</li><li>Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomenological+partial-specific+volumes+for+G-quadruplex+DNAs.">Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs.</a> Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).</li><li>Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Protein+Folding+Cooperativity+by+Differential+Scanning+Calorimetry+and+NMR+Spectroscopy.">Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy.</a> J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).</li><li>Reinstein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinine+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.+Thermodynamic+and+hydrodynamic+analysis+of+high-affinity+binding+of+an+off-target+ligand.">Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand.</a> Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).</li><li>Tellinghuisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+error+propagation.">Statistical error propagation.</a> J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).</li><li>Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+thermodynamic+analysis+of+reversible+unfolding+processes.">Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes.</a> J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).</li></ol>

Ændringer og fejlfinding
Oplysninger om den globale montering analyse anvendes i figur 1 og figur 2 er blevet beskrevet tidligere4. Her redegør vi praktiske aspekter af udføre og analysere DSC bindende eksperimenter med termolabile ligander. Bemærk at en DSC baseline opnået for den termolabile ligand alene trækkes fra liganden + biomolekyle datasæt, effektivt aflyser ud den varme frigivet...

Differential scanning kalorimetri (DSC) er en kraftfuld metode til quantitating Biomolekylær bindende og folde interaktioner1,2,3. Styrkerne ved DSC omfatter dens evne til at belyse bindende og folde mekanismer og udbytte de tilsvarende termodynamiske parametre2,3. Derudover DSC kan udføres i løsningen nær fysiologiske betingelser og kræver ikke mærkning af biomolekyle eller ligand, fxmed fluorophores, spin-etiketter eller nukleare isotoper4. Instrumentet scanner i temperatur, måle mængden af varme, der kræves til at denaturere biomolekyle i tilstedeværelse og fravær af ligand. De resulterende thermograms bruges til at udtrække de termodynamiske parametre vedrørende ligand bindende og folde processer. Oplysninger fra DSC eller andre termodynamiske teknikker er kritisk at vejlede design af narkotika målretning biomolekyler1,5,6,7,8. Men den gentagne scanning til høje temperaturer (~ 60-100 ° C) kan være problematisk. For eksempel, mange farmaceutisk vigtige forbindelser undergår omlægning eller nedbrydning ved vedvarende udsættelse for høje temperaturer9,10,11, dvs., de er termolabile. Undersøgelse af bindende interaktioner ved DSC typisk kræver flere frem og bak scanninger for at kontrollere Termogram for termodynamiske analyser12reproducerbarhed. Termisk konvertering af en indledende ligand til en sekundær form med ændrede bindende egenskaber fører til udtalte forskelle i formen og placeringen af successive thermograms, da koncentrationen af den oprindelige ligand falder med hver scanning mens den termisk konvertering produkter ophobes. Disse datasæt er ikke indstillet til traditionelle analyser.
Vi har for nylig udviklet en global montering metode for termolabile ligand DSC datasæt, der giver det komplette sæt af termodynamiske parametre vedrørende Biomolekylær foldning og bindende interaktioner fra en enkelt ligand-bundet eksperiment refereres til den nødvendige Termogram for gratis biomolekyle4. Analysen reducerer den eksperimentelle tid og prøve kræves af ~ 10-fold sammenlignet med standard DSC tilgange. Vi har tegnede sig for ligand termisk konvertering ved at påtage sig dette sker under høj temperatur-delen af hver scanning hvor Termogram ikke afhænger ligand koncentration. Ligand koncentrationen er derfor en konstant inden for del af den Termogram, som bruges til at udtrække termodynamiske parametre. Vi viste desuden, hvordan konstanten for ligand termisk konvertering kan opnås ved at udføre en supplerende eksperiment med høj temperatur ækvilibrering længere. For systemer hvor ligand termisk konvertering er mindre temperatur-afhængige (dvs.forekommer mærkbart ved alle temperaturer), analysen kan ændres til at omfatte variable ligand koncentrationer. Her vi demonstrere denne procedure for DNA aptamer MN4 i nærværelse af den termolabile ligand kokain, der hurtigt konverterer til benzoylecgonine ved høje temperaturer (> 60 ° C). Kinin er brugt som en negativ kontrol for ligand thermolability da det ikke undergår konvertering ved disse eksperimenterende temperaturer og også binder sig til MN4. Vi beskriver erhvervelse af termolabile ligand DSC datasæt og deres analyse giver termodynamisk og kinetisk parametre af folde, bindende og ligand konverteringsprocesser.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chem Impex</td>
			<td>#00829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deioinized water for molecular biology</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>H20MB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 micron sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA28145-477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 kDa centrifugal filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>131048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89068-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic DSC flange caps</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>6111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA aptamer MN4</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>22620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDSC-III microcalorimeter</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSCRun software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAnalyze software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contrad-70</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89233-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions

Differential scanning kalorimetri (DSC) er en kraftfuld teknik til kvantificering af termodynamiske parametre vedrørende Biomolekylær foldning og bindende interaktioner. Disse oplysninger er afgørende i udformningen af nye lægemiddelsammensætninger. Men mange farmaceutisk relevant ligander er kemisk ustabile ved høje temperaturer bruges i DSC analyser. Således måler bindende interaktioner udfordrende fordi koncentrationerne af ligander og termisk konverteret produkter er under konstant forandring inden for cellen NA48. Vi præsenterer her, en protokol, benytter termolabile ligander og DSC for hurtigt at opnå termodynamisk og kinetisk oplysninger på folde, bindende og ligand konverteringsprocesser. Vi har anvendt vores metode til DNA aptamer MN4, der binder termolabile ligand kokain. Ved hjælp af en ny global montering analyse, der tegner sig for termolabile ligand konvertering, det komplette sæt af foldning og bindingsparametrene er fremstillet af et par af DSC eksperimenter. Derudover viser vi, at konstanten for termolabile ligand konvertering kan opnås med kun ét supplerende DSC datasæt. Retningslinjer for at identificere og analysere data fra flere mere komplicerede scenarier præsenteres, herunder irreversibel sammenlægning af den biomolekyle, langsom folde, langsom bindende og hurtig nedbrydning af den termolabile ligand.

Repræsentative data for termolabile ligand DSC er vist i figur 1. Position og højden af den termolabile ligand-bundet peak skifter successivt mod dette af den ubundne biomolekyle som den termolabile ligand er udtømt med hver scanning (figur 1a). Gratis denaturering profil bruges som en reference til slutpunktet for termolabile ligand konvertering (figur 1b). Data for MN4 bundet til kinin er vist s...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions at JoVE.com

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Vi præsenterer en protokol for hurtig karakterisering af Biomolekylær foldning og bindende interaktioner med termolabile ligander bruger differential scanning kalorimetri.

Måling af Biomolekylær DSC profiler med termolabile ligander til hurtigt karakterisere foldning og bindende interaktioner

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Måling af G-proteinkoblet receptorreceptor via radio-mærket GTP-binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Måling af proteinbinding til F-actin ved co-sedimentering

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Påvisning af små GTPase Prenylation og GTP bindende ved hjælp af membran fraktionering og GTPase-forbundet Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Måling af interaktioner af kugleformede og fintrådede proteiner af Kernemagnetisk resonans-spektroskopi (NMR) og individuel Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interaktioner med og membran Permeabilisering af hjernen mitochondrier af amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Måling af interaktioner mellem fluorescerende sonder og lignin i plante sektioner af sFLIM baseret på naturlig Auto Luorescens

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

A Rapidly Incremented Tethered-Swimming Maximal Protocol for Cardiorespiratory Assessment of Swimmers

En hurtigt forøget Tethered-Svømning Maximal protokol for cardiorespiratory vurdering af svømmere

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Måling af nukleotidbinding til intakte, funktionelle membranproteiner i realtid

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Fjernelse og udskiftning af endogene ligands fra Lipid-Bound Proteiner og allergener

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...