Name: measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions at JoVE.com

R. W. H. V werd gesteund door het McGill Natural Sciences and Engineering Research Raad van Canada (NSERC) Training Program in Bionanomachines. A. K. M. en P. E. J. werden ondersteund door NSERC subsidies 327028-09 (A. K. M) en 238562 (P. E. J.).

1. de monstervoorbereiding
<ol><li>Zuiveren de gewenste Biomolecuul13. Opmerking: Dit protocol gebruikt gekocht cocaïne-bindende DNA aptamer MN4 na uitwisselen tegen 2 M NaCl driemaal gevolgd door drie rondes van gedeïoniseerd water met behulp van een centrifugaal filter met een 3 kDa molecuulgewicht cut-off membraan.</li>
	<li>Synthetiseren en zuiveren, of koop het gewenste thermolabile ligand-13. Opmerking: MN4 bindt de thermolabile ligand cocaïne. MN4 bindt oo...

<ol>
	<li>Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+in+life+science:+thermodynamics,+stability,+molecular+recognition+and+application+in+drug+design.">Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.</a> Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).</li><li>Privalov, P. L., Dragan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetry+of+biological+macromolecules.">Microcalorimetry of biological macromolecules.</a> Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).</li><li>Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+strong+to+ultratight+protein+interactions+using+differential+scanning+calorimetry.">Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry.</a> Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).</li><li>Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+characterization+of+folding+and+binding+interactions+with+thermolabile+ligands+by+DSC.">Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC.</a> Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).</li><li>Garbett, N. C., Chaires, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+studies+for+drug+design+and+screening.">Thermodynamic studies for drug design and screening.</a> Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).</li><li>Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+binding+thermodynamics+in+drug+discovery.">Measurements of binding thermodynamics in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).</li><li>Plotnikov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions.">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li><li>Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics-based+drug+design:+strategies+for+inhibiting+protein-protein+interactions.">Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions.</a> Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).</li><li>Peri&#225;nez Parraga, L., G-L, A., Gam&#243;n Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado S&#225;nchez, O., Puigvent&#243;s Latorre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolabile+Drugs.+Operating+Procedure+In+the+Event+of+Cold+Chain+Failure.">Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure.</a> Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).</li><li>Murray, J. B., Alshora, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+Cocaine+in+Aqueous-Solution.">Stability of Cocaine in Aqueous-Solution.</a> J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).</li><li>Waterman, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+in+pharmaceutical+formulations.">Hydrolysis in pharmaceutical formulations.</a> Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).</li><li>Mergny, J. L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thermal+melting+curves.">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li><li>Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+a+stem+length-dependent+binding+mechanism+for+the+cocaine-binding+aptamer.+A+combined+NMR+and+calorimetry+study.">Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study.</a> Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).</li><li>Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+electrophoretic+and+hydrodynamic+properties+of+DNA+and+RNA+oligonucleotide+duplexes.">Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes.</a> Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).</li><li>Durchschlag, H., Hinz, H. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , 45-128 (1986).</li><li>Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomenological+partial-specific+volumes+for+G-quadruplex+DNAs.">Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs.</a> Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).</li><li>Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Protein+Folding+Cooperativity+by+Differential+Scanning+Calorimetry+and+NMR+Spectroscopy.">Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy.</a> J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).</li><li>Reinstein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinine+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.+Thermodynamic+and+hydrodynamic+analysis+of+high-affinity+binding+of+an+off-target+ligand.">Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand.</a> Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).</li><li>Tellinghuisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+error+propagation.">Statistical error propagation.</a> J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).</li><li>Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+thermodynamic+analysis+of+reversible+unfolding+processes.">Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes.</a> J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).</li></ol>

Wijzigingen en probleemoplossing
De details van de analyse van de wereldwijde montage gebruikt in Figuur 1 en Figuur 2 zijn eerder4beschreven. We schetsen hier, praktische aspecten van het uitvoeren en analyseren van DSC bindende experimenten met thermolabile liganden. Merk op dat een basislijn DSC verkregen voor de thermolabile ligand alleen wordt afgetrokken van het ligand + Biomolecuul datase...

Differentiële scanning calorimetrie (DSC) is een krachtige methode om quantitating biomoleculaire bindende en opvouwbare interacties1,-2,3. De sterke punten van DSC omvatten haar capaciteit te verhelderen bindend en vouwen van mechanismen en opleveren van het desbetreffende thermodynamische parameters2,3. Bovendien, DSC kan worden uitgevoerd in de oplossing in de buurt van de fysiologische omstandigheden en vereist geen etikettering van de Biomolecuul of ligand, bijvoorbeeldmet fluorophores, spin-etiketten of nucleaire isotopen4. Het instrument scant in temperatuur, het meten van de hoeveelheid warmte die nodig is om te denatureren van de Biomolecuul in de aanwezigheid en de afwezigheid van ligand. De resulterende thermograms worden gebruikt voor het uitpakken van de thermodynamische parameters betreffende de ligand bindend en vouwen van processen. De door de DSC- of andere thermodynamische technieken verstrekte informatie is cruciaal voor het begeleiden van het ontwerp van drugs gericht op biomoleculen1,5,6,7,8. Echter de herhaalde scannen naar hoge temperaturen (~ 60-100 ° C) problematisch kan zijn. Bijvoorbeeld, veel farmaceutisch belangrijke stoffen ondergaan omlegging of ontleding bij langdurige blootstelling aan hoge temperaturen9,10,11, dat wil zeggen, ze zijn thermolabile. Behandeling van bindende interacties door DSC meestal meebrengt dat meerdere voorwaartse en omgekeerde scans om na te gaan van de reproduceerbaarheid van het thermogram voor thermodynamische analyses12. Thermische conversie van een eerste ligand naar een secundaire vorm met gewijzigde bindende eigenschappen leidt tot uitgesproken verschillen in de vorm en positie van opeenvolgende thermograms, aangezien de concentratie van de oorspronkelijke ligand met elke scan terwijl afneemt de thermische conversie producten ophopen. Deze datasets zijn niet vatbaar voor traditionele analyses.
Onlangs hebben we een globale montage methode voor thermolabile ligand DSC datasets dat de opbrengst van de complete set van thermodynamische parameters betreffende de Biomoleculaire vouwen en bindende interacties van een enkele ligand-gebonden experiment waarnaar wordt verwezen naar de vereiste thermogram voor de gratis Biomolecuul4. De analyse vermindert de experimentele tijd en monster vereist door ~ 10-fold in vergelijking met standaard DSC benaderingen. We hebben goed voor ligand thermische conversie door de veronderstelling dat dit gebeurt tijdens het gedeelte van de hoge temperatuur van elke scan waar de thermogram niet afhankelijk ligand concentratie. Daarom is de ligand concentratie een constante in het gedeelte van het thermogram die wordt gebruikt voor het uitpakken van de thermodynamische parameters. We laten bovendien zien hoe de constant voor ligand thermische conversie kan worden verkregen door het uitvoeren van één aanvullende experiment met een langere equilibratietijd hoge temperatuur. Voor systemen waar ligand thermische conversie minder afhankelijk van de temperatuur is (dat wil zeggen, zich merkbaar bij alle temperaturen), de analyse kan worden gewijzigd als u wilt opnemen van variabele ligand concentraties. Hier laten wij zien deze procedure voor de aptamer van DNA MN4 in aanwezigheid van de cocaïne thermolabile ligand, die snel worden omgezet in benzoylecgonine bij hoge temperaturen (> 60 ° C). Kinine wordt gebruikt als een negatieve controle voor ligand thermolability omdat het geen conversie bij deze experimentele temperaturen ondergaan en ook aan MN4 bindt. We beschrijven de overname van thermolabile ligand DSC datasets en hun analyse opbrengst thermodynamische en kinetische parameters van de vouwing, bindende en ligand conversie processen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chem Impex</td>
			<td>#00829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deioinized water for molecular biology</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>H20MB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 micron sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA28145-477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 kDa centrifugal filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>131048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89068-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic DSC flange caps</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>6111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA aptamer MN4</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>22620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDSC-III microcalorimeter</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSCRun software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAnalyze software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contrad-70</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89233-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions

Differentiële scanning calorimetrie (DSC) is een krachtige techniek voor het kwantificeren van de thermodynamische parameters bestuur biomoleculaire vouwen en bindende interacties. Deze informatie is cruciaal in het ontwerp van nieuwe farmaceutische stoffen. Er zijn echter vele farmaceutisch relevante liganden chemisch onstabiele bij de hoge temperaturen gebruikt in DSC analyses. Dus is bindende interacties te meten uitdagend omdat de concentraties van liganden en thermisch-geconverteerde producten voortdurend binnen de calorimeter-cel veranderen. Hier presenteren we een protocol met behulp van thermolabile liganden en DSC voor het snel verkrijgen thermodynamische en kinetische gegevens op de vouwing, bindende en ligand conversie processen. We hebben onze methode toegepast op de aptamer van DNA MN4 dat zich aan de thermolabile ligand cocaïne bindt. Met behulp van een nieuwe globale montage analyse die goed is voor thermolabile ligand conversie, de complete set van vouwen en bindende parameters worden verkregen van een paar van DSC experimenten. Bovendien laten we zien dat de constante snelheid voor thermolabile ligand conversie met slechts één aanvullende DSC dataset kan worden verkregen. De richtsnoeren voor het identificeren en analyseren van gegevens uit verschillende ingewikkelder scenario's worden gepresenteerd, met inbegrip van onomkeerbare bundeling van de Biomolecuul, langzame vouwing, langzame bindende en snelle uitputting van de thermolabile ligand.

Representatieve gegevens voor de thermolabile ligand-DSC zijn afgebeeld in Figuur 1. De positie en de hoogte van de thermolabile ligand-gebonden piek verschuift achtereenvolgens naar beneden naar die van de niet-afhankelijke Biomolecuul aangezien de thermolabile ligand is uitgeput met elke scan (Figuur 1a). Het gratis denaturatie profiel wordt gebruikt als referentie voor het eindpunt van de thermolabile ligand conversie (<strong...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions at JoVE.com

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Presenteren we een protocol voor snelle karakterisering van biomoleculaire vouwen en inbinden interacties met thermolabile liganden met behulp van differentiële scanning calorimetrie.

Biomoleculaire DSC profielen met Thermolabile liganden te karakteriseren snel vouwen en inbinden van interacties te meten

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tijdsgeresolveerde elektrosprayionisatie waterstof-deuterium Exchange Massaspectrometrie voor het bestuderen van Protein Structure en Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Het meten van G-eiwit-gekoppelde Receptor Signaling via Radio-gelabeld GTP Binding

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Meting van eiwitbinding aan F-actine door co-sedimentatie

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Detectie van kleine GTPase Prenylation en GTP bindend gebruiken membraan fractionering en GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Meten van interacties van bolvormige en filamenteuze eiwitten door nucleaire magnetische resonantie spectroscopie (NMR) en Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Interacties met en membraan Permeabilization van de mitochondriën van de hersenen door amyloid fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Meten van interacties tussen fluorescentie sondes en lignine in plantendelen door sFLIM op basis van inheemse Autofluorescentie

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

A Rapidly Incremented Tethered-Swimming Maximal Protocol for Cardiorespiratory Assessment of Swimmers

Een snel verhoogd tethered-swimming maximum protocol voor cardiorespiratoire beoordeling van zwemmers

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Het meten van nucleotidebinding aan intacte, functionele membraaneiwitten in realtime

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Verwijdering en vervanging van endogene liganden uit lipidegebonden eiwitten en allergenen

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...