Name: measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions at JoVE.com

R. W. H. V wurde von der McGill Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada (NSERC) Schulungsprogramm in Bionanomachines unterstützt. A. K. M. und P. E. J. wurden von NSERC Zuschüsse 327028-09 (A. K. M) und 238562 (P. E. J.) unterstützt.

1. die Probenvorbereitung
<ol><li>Reinigen Sie die gewünschte Biomolekül13. Hinweis: Dieses Protokoll verwendet gekauft Kokain-Bindung DNA-Aptamer MN4 nach dem Austausch gegen 2 M NaCl dreimal gefolgt von drei Runden von entionisiertem Wasser mit einem zentrifugalen Filter mit einer 3 kDa Molekulargewicht Cut-off Membran.</li>
	<li>Synthetisieren Sie und zu reinigen Sie, oder kaufen Sie die gewünschte thermolabilen Liganden-13. Hinweis: MN4 bindet die thermolabil...

<ol>
	<li>Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+in+life+science:+thermodynamics,+stability,+molecular+recognition+and+application+in+drug+design.">Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.</a> Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).</li><li>Privalov, P. L., Dragan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetry+of+biological+macromolecules.">Microcalorimetry of biological macromolecules.</a> Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).</li><li>Brandts, J. F., Lin, L. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+studies+for+drug+design+and+screening.">Thermodynamic studies for drug design and screening.</a> Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).</li><li>Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+binding+thermodynamics+in+drug+discovery.">Measurements of binding thermodynamics in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).</li><li>Plotnikov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions.">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li><li>Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics-based+drug+design:+strategies+for+inhibiting+protein-protein+interactions.">Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions.</a> Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).</li><li>Peri&#225;nez Parraga, L., G-L, A., Gam&#243;n Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado S&#225;nchez, O., Puigvent&#243;s Latorre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolabile+Drugs.+Operating+Procedure+In+the+Event+of+Cold+Chain+Failure.">Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure.</a> Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).</li><li>Murray, J. B., Alshora, H. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , 45-128 (1986).</li><li>Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomenological+partial-specific+volumes+for+G-quadruplex+DNAs.">Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs.</a> Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).</li><li>Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Protein+Folding+Cooperativity+by+Differential+Scanning+Calorimetry+and+NMR+Spectroscopy.">Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy.</a> J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).</li><li>Reinstein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinine+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.+Thermodynamic+and+hydrodynamic+analysis+of+high-affinity+binding+of+an+off-target+ligand.">Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand.</a> Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).</li><li>Tellinghuisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+error+propagation.">Statistical error propagation.</a> J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).</li><li>Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+thermodynamic+analysis+of+reversible+unfolding+processes.">Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes.</a> J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).</li></ol>

Modifikationen und Fehlerbehebung
Die Details der globalen passende Analyse verwendet in Abbildung 1 und Abbildung 2 wurden4beschrieben. Hier beschreiben wir die praktischen Aspekte der Durchführung und Analyse von DSC verbindliche Experimente mit thermolabilen Liganden. Beachten Sie, dass Basispläne DSC erhalten für thermolabile Liganden allein von den Liganden subtrahiert wird + Biomolekül...

Differential scanning-Kalorimetrie (DSC) ist eine leistungsfähige Methode zur Quantifizierung biomolekularen Bindung und faltende Wechselwirkungen1,2,3. Die Stärken der DSC gehören seine Fähigkeit zur Bindung und Falten Mechanismen aufzuklären und zu der entsprechenden thermodynamischen Parameter2,3. Darüber hinaus DSC kann in Lösung in der Nähe von physiologischen Bedingungen durchgeführt werden und erfordert keine Kennzeichnung der Biomolekül oder Liganden, z. B.mit Fluorophore, Spin-Etiketten oder nuklearen Isotope4. Das Gerät scannt in Temperatur, Messung der Menge an Wärme benötigt, um das Biomolekül in an- und Abwesenheit des Liganden zu denaturieren. Die daraus resultierende Thermogramme werden verwendet, um die thermodynamischen Parameter den Liganden binden und Faltung Prozesse zu extrahieren. DSC oder anderen thermodynamischen Verfahren übermittelten Informationen ist entscheidend für die Führung der Gestaltung der Medikamente gegen Biomoleküle1,5,6,7,8. Jedoch das wiederholte Scannen zu hohen Temperaturen (~ 60-100 ° C) kann problematisch sein. Zum Beispiel viele pharmazeutisch wichtige Verbindungen zu unterziehen, Rearrangement oder Zersetzung auf anhaltende Exposition gegenüber hohen Temperaturen9,10,11, d. h., sie sind thermolabilen. Prüfung von verbindlichen Interaktionen von DSC in der Regel erfordert Mehrfachscans vorwärts und rückwärts um die Reproduzierbarkeit der Thermogramm für thermodynamische Analysen12zu überprüfen. Thermische Umwandlung von einer anfänglichen Liganden an einen sekundären Formen mit veränderten Bindungseigenschaften führt zu ausgeprägten Unterschiede in Form und Position der aufeinanderfolgenden Thermogramme, da verringert sich die Konzentration des ersten Liganden mit jedem Scan während der thermische Umwandlungsprodukte ansammeln. Diese Datensätze sind nicht traditionelle Analysen zugänglich.
Vor kurzem haben wir eine globale Anpassungsmethode für thermolabile Liganden DSC-Datasets, die die Gesamtheit der thermodynamischen Parameter für die biomolekularen Faltung und bindende Wechselwirkungen aus einem einzigen Liganden gebundenes Experiment bezogen auf ergibt die erforderlichen Thermogramm für die kostenlose Biomolekül-4. Die Analyse reduziert den experimentellen Probe vorgeschriebenen ~ 10-fach im Vergleich zu standard-DSC-Ansätze. Wir haben entfielen für Liganden thermische Umwandlung von vorausgesetzt, dies geschieht während der Hochtemperatur-Teil für jeden Scan wo das Thermogramm nicht Liganden-Konzentration hängt. Daher ist die Liganden-Konzentration eine konstante innerhalb des Teils des Thermogramm, die verwendet wird, um thermodynamische Parameter zu extrahieren. Wir zusätzlich gezeigt, wie die Geschwindigkeitskonstante für Ligand thermische Umwandlung erreicht werden kann, durch eine ergänzende Experiment mit Hochtemperatur Gleichgewichtherstellung länger ausführen. Für Systeme, wo Liganden thermische Umwandlung weniger temperaturabhängig (d.h.auftretenden spürbar bei allen Temperaturen), die Analyse kann geändert werden, um Variable Liganden Konzentrationen enthalten. Hier zeigen wir dieses Verfahren zur DNA-Aptamer MN4 in Anwesenheit von thermolabilen Liganden Kokain, die schnell zum Benzoylecgonin bei hohen Temperaturen Konvertiten (> 60 ° C). Chinin wird als Negativkontrolle für Liganden Thermolability verwendet, da es Konvertierung bei diesen experimentellen Temperaturen nicht unterziehen und auch an MN4 bindet. Wir beschreiben den Erwerb von thermolabilen Liganden DSC Datasets und ihre Analyse nachgeben thermodynamischen und kinetischen Parameter der Faltung, Bindung und Liganden Konvertierungsprozesse.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chem Impex</td>
			<td>#00829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deioinized water for molecular biology</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>H20MB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 micron sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA28145-477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 kDa centrifugal filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>131048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89068-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic DSC flange caps</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>6111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA aptamer MN4</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>22620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDSC-III microcalorimeter</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSCRun software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAnalyze software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contrad-70</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89233-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions

Differential scanning-Kalorimetrie (DSC) ist ein leistungsfähiges Verfahren zur Quantifizierung der thermodynamischen Parameter für biomolekulare Falt- und bindender Wechselwirkungen. Diese Information ist entscheidend bei der Gestaltung neuer Arzneimittel zur Behandlung. Allerdings sind viele pharmazeutisch relevante Liganden chemisch instabil bei den hohen Temperaturen im DSC-Analysen verwendet. So messen bindender Wechselwirkungen wird schwierig, da die Konzentrationen von Liganden und thermisch umgewandelt Produkte innerhalb der Kalorimeter Zelle ständig in Bewegung sind. Hier präsentieren wir ein Protokoll mit thermolabilen Liganden und DSC für schnell Informationsbeschaffung thermodynamischen und kinetischen auf die Falten, Bindung und Liganden Konvertierungsprozesse. Wir haben unsere Methode auf die DNA-Aptamer MN4 angewandt, die das Kokain thermolabilen Liganden bindet. Verwenden eine neue globale Fitting-Analyse, die Konten für thermolabile Liganden Umwandlung, die Gesamtheit der Faltung und Bindungsparameter stammen aus ein paar DSC Experimente. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Geschwindigkeitskonstante für thermolabile Liganden Konvertierung mit nur einem zusätzlichen DSC Dataset bezogen werden kann. Die Leitlinien für die Identifizierung und Analyse von Daten aus mehreren komplizierter Szenarien werden vorgestellt, einschließlich irreversible Aggregation der Biomolekül, langsam Falten, langsame verbindliche und schnelle Entleerung des thermolabilen Liganden.

Repräsentative Daten für den DSC thermolabilen Liganden sind in Abbildung 1dargestellt. Die Position und Höhe des thermolabilen Liganden gebundenes Peaks rückt sukzessive nach unten, die das ungebundene Biomolekül thermolabile Liganden mit jedem Scan (Abbildung 1a) erschöpft ist. Das kostenlose Denaturierung-Profil dient als Referenz für den Endpunkt der thermolabilen Liganden Umwandlung (Abbildung 1 b...

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Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll für schnelle Charakterisierung der biomolekularen Faltung und Interaktionen mit thermolabilen Liganden mit differential scanning Kalorimetrie verbindlich.

Messprofile biomolekularen DSC mit thermolabilen Liganden schnell zu charakterisieren, Falt- und bindende Wechselwirkungen

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Forschung

Biochemie

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Messung der Proteinbindung an F-Aktin durch Co-Sedimentation

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Erkennung von kleine GTPase Prenylation und GTP binden mit Membran Fraktionierung und GTPase verbundene Immunosorbentprobe Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Messung der Interaktionen von Kugelsternhaufen und filamentösen Proteinen Kernresonanzspektroskopie (NMR) und Microscale Thermophorese (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Wechselwirkungen mit und Membranpermeabilisierung des Gehirns Mitochondrien durch Amyloid Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Messung von Wechselwirkungen zwischen fluoreszierenden Sonden und Lignin in Pflanzenabschnitten durch sFLIM basierend auf nativer Autofluoreszenz

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

A Rapidly Incremented Tethered-Swimming Maximal Protocol for Cardiorespiratory Assessment of Swimmers

Ein schnell inkrementiertes Tethered-Swimming-Maximalprotokoll zur kardiorspiratorischen Beurteilung von Schwimmern

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

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We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Entfernung und Ersatz endogener Liganden aus lipidgebundenen Proteinen und Allergenen

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...