Name: measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions at JoVE.com

V ח וו ר נתמכה על ידי מדעי הטבע מקגיל תוכנית אימונים הנדסה מחקר המועצה של קנדה (NSERC) ב- Bionanomachines. א ק מ ופי אי ג'יי נתמכו על ידי מענקים NSERC 327028-09 (א ק ז), 238562 (פי אי ג'יי).

1. הכנת הדוגמא
<ol><li>לטהר את biomolecule הרצוי13. הערה: זה פרוטוקול שימושים לרכוש קוקאין-איגוד ה-DNA aptamer MN4 לאחר החלפת נגד 2 M NaCl 3 פעמים ואחריו שלושה סבבי מים יונים באמצעות מסנן צנטריפוגלי עם קרום ניתוק משקל מולקולרי 3 kDa.</li>
	<li>לסנתז, לטהר, או לרכוש את הרצוי ליגנד thermolabile13. ה...

<ol>
	<li>Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+in+life+science:+thermodynamics,+stability,+molecular+recognition+and+application+in+drug+design.">Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.</a> Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).</li><li>Privalov, P. L., Dragan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetry+of+biological+macromolecules.">Microcalorimetry of biological macromolecules.</a> Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).</li><li>Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+strong+to+ultratight+protein+interactions+using+differential+scanning+calorimetry.">Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry.</a> Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).</li><li>Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+characterization+of+folding+and+binding+interactions+with+thermolabile+ligands+by+DSC.">Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC.</a> Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).</li><li>Garbett, N. C., Chaires, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+studies+for+drug+design+and+screening.">Thermodynamic studies for drug design and screening.</a> Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).</li><li>Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+binding+thermodynamics+in+drug+discovery.">Measurements of binding thermodynamics in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).</li><li>Plotnikov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions.">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li><li>Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics-based+drug+design:+strategies+for+inhibiting+protein-protein+interactions.">Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions.</a> Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).</li><li>Peri&#225;nez Parraga, L., G-L, A., Gam&#243;n Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado S&#225;nchez, O., Puigvent&#243;s Latorre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolabile+Drugs.+Operating+Procedure+In+the+Event+of+Cold+Chain+Failure.">Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure.</a> Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).</li><li>Murray, J. B., Alshora, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+Cocaine+in+Aqueous-Solution.">Stability of Cocaine in Aqueous-Solution.</a> J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).</li><li>Waterman, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+in+pharmaceutical+formulations.">Hydrolysis in pharmaceutical formulations.</a> Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).</li><li>Mergny, J. L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thermal+melting+curves.">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li><li>Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+a+stem+length-dependent+binding+mechanism+for+the+cocaine-binding+aptamer.+A+combined+NMR+and+calorimetry+study.">Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study.</a> Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).</li><li>Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+electrophoretic+and+hydrodynamic+properties+of+DNA+and+RNA+oligonucleotide+duplexes.">Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes.</a> Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).</li><li>Durchschlag, H., Hinz, H. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , 45-128 (1986).</li><li>Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomenological+partial-specific+volumes+for+G-quadruplex+DNAs.">Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs.</a> Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).</li><li>Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Protein+Folding+Cooperativity+by+Differential+Scanning+Calorimetry+and+NMR+Spectroscopy.">Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy.</a> J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).</li><li>Reinstein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinine+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.+Thermodynamic+and+hydrodynamic+analysis+of+high-affinity+binding+of+an+off-target+ligand.">Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand.</a> Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).</li><li>Tellinghuisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+error+propagation.">Statistical error propagation.</a> J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).</li><li>Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+thermodynamic+analysis+of+reversible+unfolding+processes.">Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes.</a> J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).</li></ol>

שינויים ופתרון בעיות
הפרטים של הניתוח התאמה העולמית בשימוש איור 1 , איור 2 היה שתואר לעיל4. כאן, אנחנו חלוקה לרמות ההיבטים המעשיים של ביצוע וניתוח DSC מחייב בין ניסויים ליגנדים thermolabile. שימו לב כי תוכנית בסיסית DSC להשיג עבור ?...

דיפרנציאלית סריקה calorimetry (DSC) היא שיטה חזקה עבור איגוד למערכות ביולוגיות quantitating ומתקפלים אינטראקציות1,2,3. נקודות החוזק של DSC כוללים את יכולתו להבהיר מחייב וקיפול מנגנונים, תשואה של2,המקביל פרמטרים תרמודינמי3. יתר על כן, DSC יכול להתבצע בפתרון בתנאים ליד-פיזיולוגיים, לא דורשת תיוג של biomolecule או ליגנד, למשל, עם fluorophores, ספין-תוויות או גרעינית איזוטופים4. המכשיר סורק בטמפרטורה, מודדים את כמות החום הדרושה כדי denature את biomolecule, הנוכחות ואת היעדר ליגנד. Thermograms שנוצר משמשים כדי לחלץ את הפרמטרים תרמודינמי המסדירים את ליגנד מחייב וקיפול תהליכים. המידע שנמסר על ידי DSC או בטכניקות אחרות תרמודינמי חיוני המנחה את העיצוב של שהתרופות המתוות מולקולות1,5,6,7,8. עם זאת, סריקה חוזרת ונשנית לטמפרטורות גבוהות (~ 60-100 ° C) יכול להיות בעייתי. לדוגמה, תרכובות הם חשובים רבים עוברים סידור או ריקבון על חשיפה מתמשכת בטמפרטורות גבוהות9,10,11, קרי, הם thermolabile. בחינה של איגוד אינטראקציות על ידי DSC בדרך כלל דורש מספר סריקות ואחורה כדי לאמת את הפארמצבטית של תמוגרפיה ניתוח תרמודינמי12. המרה תרמי של ליגנד הראשונית בטופס משני עם איגוד שינו מאפיינים מוביל בולטת הבדלים הצורה והמיקום של thermograms רצופות, מאז ריכוז ליגנד הראשונית יורדת עם כל סריקה בזמן ההמרה התרמית מוצרים לצבור. אלה נתונים (datasets) נתונות לא ניתוח מסורתי.
לאחרונה פיתחנו שיטת המדידה הכללית datasets ליגנד thermolabile DSC המניבה את הערכה המלאה של פרמטרים תרמודינמי המסדירים את הקיפולים למערכות ביולוגיות ואיגוד אינטראקציות של ניסוי מאוגד-ליגנד אחד הפניה תמוגרפיה כנדרש עבור חינם biomolecule4. הניתוח מקטין את זמן הניסוי ואת מדגם הנדרש על-ידי ~ 10-fold בהשוואה הגישות DSC סטנדרטי. יש לנו פיתרון ליגנד ההמרה התרמית שייטול את זה קורה במהלך החלק בטמפרטורה גבוהה של כל סריקה איפה תמוגרפיה אינו תלוי בריכוז ליגנד. לכן, ריכוז ליגנד הוא קבוע בתוך החלק של תמוגרפיה המשמש כדי לחלץ תרמודינמי פרמטרים. בנוסף להדגים איך קצב קבוע לגיור תרמי ליגנד יכולה להיות מושגת על ידי ביצוע ניסוי משלים אחד עם פרק זמן ארוך יותר equilibration בטמפרטורה גבוהה. עבור מערכות ההמרה התרמית ליגנד איפה פחות תלוית טמפרטורה (קרי, המתרחשים ניכרת בטמפרטורות כל), הניתוח יכול להיות שונה כדי לכלול ריכוזים ליגנד משתנה. כאן אנחנו מוכיחים את הליך זה עבור aptamer DNA MN4 בנוכחות הקוקאין ליגנד thermolabile, אשר ממירה במהירות benzoylecgonine בטמפרטורות גבוהות (> 60 ° C). כינין משמש פקד שלילי ליגנד thermolability כיוון שהוא אינו עובר המרה בטמפרטורות אלה ניסיוני נקשר גם MN4. אנו מתארים הרכישה של ליגנד thermolabile DSC datasets וניתוח שלהם מניב פרמטרים תרמודינמי, קינטי של קיפול, איגוד, ליגנד תהליכי ההמרה.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chem Impex</td>
			<td>#00829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deioinized water for molecular biology</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>H20MB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 micron sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA28145-477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 kDa centrifugal filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>131048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89068-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic DSC flange caps</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>6111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA aptamer MN4</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>22620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDSC-III microcalorimeter</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSCRun software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAnalyze software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contrad-70</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89233-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions

דיפרנציאלית סריקה calorimetry (DSC) היא טכניקה חזקה לכימות תנועת תרמודינמי פרמטרים הנוגעים למערכות ביולוגיות קיפול ואינטראקציות מחייב. מידע זה חיוני בעיצוב של תרכובות פרמצבטיות חדש. אולם, רבים ליגנדים הרלוונטיים הם הם לא יציב מבחינה כימית בטמפרטורות גבוהות בשימוש DSC ניתוחים. לפיכך, מדידת אינטראקציות מחייב הוא מאתגר כי הריכוזים של ליגנדים ומוצרים המרה תרמית משתנים ללא הרף בתוך התא קלורימטר. כאן, אנו מציגים פרוטוקול באמצעות ליגנדים thermolabile ו DSC להשגת במהירות מידע תרמודינמי קינטי קיפול, האיגוד, לבין ליגנד תהליכי ההמרה. אנחנו החלת שיטת שלנו aptamer ה-DNA MN4 המאגד הקוקאין ליגנד thermolabile. באמצעות ניתוח כללי התאמה חדשים that חשבונות for ליגנד thermolabile ההמרה, הערכה המלאה של קיפול ופרמטרים איגוד מתקבלים מן זוג ניסויים DSC. בנוסף, נראה כי ניתן להשיג את קצב קבוע עבור המרה ליגנד thermolabile עם dataset DSC משלים אחד בלבד. ההנחיות לזיהוי וניתוח נתונים של מספר תרחישים יותר מסובך מוצגים, כולל צבירת בלתי הפיך של biomolecule, קיפול איטי, איגוד איטי, דלדול מהירה ליגנד thermolabile.

נציג נתונים עבור DSC ליגנד thermolabile מוצגים באיור1. המיקום ואת גובה הפסגה מאוגד-ליגנד thermolabile במרוכז משמרות לכיוון של biomolecule לא מאוגד כמו ליגנד thermolabile תיגמר עם כל סריקה (איור 1 א'). הפרופיל דנטורציה חינם משמש כייחוס עבור נקודת הקצה של ליגנד thermolabile...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions at JoVE.com

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

אנו מציגים פרוטוקול פלואורסנציה למערכות ביולוגיות קיפול ואיגוד אינטראקציות עם thermolabile ליגנדים שימוש דיפרנציאלי calorimetry סריקה מהירה.

מדידת למערכות ביולוגיות DSC פרופילים עם Thermolabile ליגנדים לאפיין במהירות קיפול ואיגוד אינטראקציות

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

מדידת G- חלבון מצמידים איתות באמצעות רדיו שכותרתו GTP מחייב

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

מדידת חלבון מחייב F- אקטין על ידי שיתוף שקיעה

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

זיהוי של GTPase Prenylation קטן ו GTP איגוד באמצעות ממברנה Fractionation ו GTPase-מקושרים Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

מדידת אינטראקציות של חלבונים הכדוריים, Filamentous על ידי תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR) Microscale Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

אינטראקציות עם חדירות ממברנה של המיטותית המוח על ידי עמילואיד Fibrils

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

מדידת אינטראקציות בין הפלורסנט לליגנין בסעיפים צמחיים על ידי sFLIM בהתבסס על מבוסס על קרינה פלואורסצנטית מקורית

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

A Rapidly Incremented Tethered-Swimming Maximal Protocol for Cardiorespiratory Assessment of Swimmers

פרוטוקול מקסימלי בעל שחייה בצמיחה מהירה באמצעות שחיה על הערכת שחיינים

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

מדידת קשירת נוקלאוטידים לחלבוני ממברנה שלמים ומתפקדים בזמן אמת

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

הסרה והחלפה של ליגנדים אנדוגניים מחלבונים ואלרגנים הקשורים לשומנים

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...