Name: measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00
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R. W. H. V era sostenuta dalla McGill scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC) programma di formazione in Bionanomachines. A. K. M. e P. E. J. sono stati sostenuti da borse di studio NSERC 327028-09 (A. K. M) e 238562 (E. J.).

1. preparazione del campione
<ol><li>Purificare la biomolecola desiderato13. Nota: Questo protocollo usi acquistati cocaina-associazione DNA aptamer MN4 dopo lo scambio contro 2 M NaCl, tre volte seguito da tre turni di acqua deionizzata utilizzando un filtro centrifugo con una membrana di cut-off di peso molecolare 3 kDa.</li>
	<li>Sintetizzare e purificare, oppure acquistare il ligando termolabile desiderato13. Nota: MN4 associa la cocaina ligando termolabili. MN4...

<ol>
	<li>Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+in+life+science:+thermodynamics,+stability,+molecular+recognition+and+application+in+drug+design.">Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.</a> Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).</li><li>Privalov, P. L., Dragan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetry+of+biological+macromolecules.">Microcalorimetry of biological macromolecules.</a> Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).</li><li>Brandts, J. F., Lin, L. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomenological+partial-specific+volumes+for+G-quadruplex+DNAs.">Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs.</a> Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).</li><li>Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Protein+Folding+Cooperativity+by+Differential+Scanning+Calorimetry+and+NMR+Spectroscopy.">Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy.</a> J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).</li><li>Reinstein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinine+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.+Thermodynamic+and+hydrodynamic+analysis+of+high-affinity+binding+of+an+off-target+ligand.">Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand.</a> Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).</li><li>Tellinghuisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+error+propagation.">Statistical error propagation.</a> J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).</li><li>Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+thermodynamic+analysis+of+reversible+unfolding+processes.">Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes.</a> J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).</li></ol>

Le modifiche e la risoluzione dei problemi
I dettagli dell'analisi raccordo globale utilizzato nella Figura 1 e Figura 2 sono stati descritti in precedenza4. Qui, descriviamo gli aspetti pratici dell'esecuzione e l'analisi di esperimenti di binding DSC con ligandi termolabili. Si noti che una previsione di DSC ottenuta per il ligando termolabile da solo viene sottratto dal ligando + biomolecola ...

Calorimetria a scansione differenziale (DSC) è un metodo potente per quantificazione associazione biomolecolari e pieghevole interazioni1,2,3. I punti di forza della DSC includono la capacità di delucidare vincolante e pieghevole meccanismi e per produrre i corrispondenti parametri termodinamici2,3. Inoltre, la DSC può essere eseguita in soluzione in condizioni di quasi-fisiologiche e non richiede etichettatura di biomolecole o legante, ad esempio, con fluorofori, spin-etichette o isotopi nucleari4. Lo strumento esegue la scansione di temperatura, la misurazione della quantità di calore necessaria per denaturare la biomolecola in presenza e in assenza del ligando. I termogrammi risultante vengono utilizzate per estrarre i parametri termodinamici che disciplinano il ligando vincolanti e processi di piegatura. Le informazioni fornite da DSC o altre tecniche termodinamici sono fondamentale per guidare la progettazione di farmaci targeting biomolecole1,5,6,7,8. Tuttavia, la scansione ripetuta ad alte temperature (~ 60-100 ° C) può essere problematico. Ad esempio, molti composti farmacologicamente importanti subiscono riorganizzazione o decomposizione all'esposizione continua a temperature elevate9,10,11, vale a dire, essi sono termolabili. Esame dell'associazione interazioni di DSC in genere richiede più scansioni di avanti e indietro al fine di verificare la riproducibilità del termogramma per analisi termodinamica12. Conversione termica di un ligando iniziale di una forma secondaria con caratteristiche di associazione alterata conduce a pronunciate differenze nella forma e posizione dei termogrammi successivi, poiché la concentrazione del ligando iniziale diminuisce con ogni scansione mentre il conversione termica prodotti si accumulano. Questi set di dati non sono suscettibili di analisi tradizionali.
Recentemente abbiamo sviluppato un metodo di raccordo globale per i DataSet di ligando termolabile DSC che produce il set completo dei parametri termodinamici che disciplinano la piegatura biomolecolari e associazione interazioni da un singolo esperimento-ligando viene fatto riferita per la termogramma necessaria per la biomolecola libero4. L'analisi riduce il tempo sperimentale e il campione richiesto da ~ 10 volte rispetto agli approcci standard DSC. Abbiamo rappresentato per il ligando conversione termica assumendo questo succede durante la parte ad alta temperatura di ogni scansione dove il termogramma non dipende dalla concentrazione del ligando. Di conseguenza, la concentrazione del ligando è una costante all'interno della parte del termogramma che viene utilizzato per estrarre i parametri termodinamici. Abbiamo inoltre dimostrato come la costante di velocità per la conversione termica ligando possa essere ottenuta eseguendo un esperimento supplementare con un periodo più lungo di equilibratura ad alta temperatura. Per sistemi in cui la conversione termica ligando è meno temperatura-dipendente (cioè, che si verificano sensibilmente a tutte le temperature), l'analisi può essere modificato per includere le concentrazioni di ligando variabile. Qui dimostriamo questa procedura per il DNA aptamero MN4 in presenza di cocaina ligando termolabili, che converte rapidamente in benzoilecgonina ad alte temperature (> 60 ° C). Chinina è usata come controllo negativo per thermolability ligando poiché non sottoposti a conversione a queste temperature sperimentale e si lega anche al MN4. Descriviamo l'acquisizione di ligando termolabile DSC DataSet e loro analisi producendo i parametri termodinamici e cinetici del pieghevole, associazione e ligando processi di conversione.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chem Impex</td>
			<td>#00829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deioinized water for molecular biology</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>H20MB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 micron sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA28145-477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 kDa centrifugal filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>131048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89068-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic DSC flange caps</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>6111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA aptamer MN4</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>22620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDSC-III microcalorimeter</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSCRun software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAnalyze software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contrad-70</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89233-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions

Calorimetria a scansione differenziale (DSC) è una tecnica potente per quantificare i parametri termodinamici che disciplinano biomolecolari pieghevole e interazione di legame. Questa informazione è fondamentale nella progettazione di nuovi composti farmaceutici. Tuttavia, molti ligandi farmacologicamente rilevanti sono chimicamente instabili alle alte temperature utilizzate nelle analisi DSC. Così, associazione di interazioni di misurazione è difficile perché le concentrazioni di ligandi e termicamente convertiti i prodotti sono in continua evoluzione all'interno della cellula del calorimetro. Qui, presentiamo un protocollo utilizzando ligandi termolabile e DSC per rapidamente ottenere informazioni termodinamiche e cinetiche sulla piegatura, l'associazione e ligando processi di conversione. Abbiamo applicato il nostro metodo per il DNA aptamero MN4 che associa la cocaina ligando termolabili. Utilizzando una nuova analisi di raccordo globale che i conti per la conversione di ligando termolabili, il set completo dei parametri di associazione e pieghevole si ottengono da un paio di esperimenti di DSC. Inoltre, ci mostra che la costante di velocità per la conversione di ligando termolabile può essere ottenuta con un solo set di dati supplementari DSC. Le linee guida per l'identificazione e l'analisi dei dati da diversi scenari più complessi è presentata, compreso irreversibile aggregazione della biomolecola, pieghevole lento, lento l'associazione e lo svuotamento rapido del ligando termolabile.

Dati rappresentativi per il ligando termolabile DSC sono mostrati nella Figura 1. La posizione e l'altezza del picco-ligando termolabile sposta successivamente verso quella di biomolecole non associata come il ligando termolabile è esaurito con ogni scansione (Figura 1a). Il profilo di denaturazione gratuito è utilizzato come riferimento per l'endpoint di conversione ligando termolabile (Figura 1b)...

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Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Vi presentiamo un protocollo per la rapida caratterizzazione biomolecolare pieghevole e associazione interazioni con ligandi termolabile mediante calorimetria differenziale a scansione.

Misurazione di profili biomolecolari DSC con ligandi termolabile per caratterizzare velocemente pieghevole e associazione interazioni

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

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