Name: measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00
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R. W. H. V 맥 길 자연 과학 및 캐나다 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC) 교육 프로그램 Bionanomachines에 의해 지원 되었다. A. K. M. 및 P. E. J. NSERC 보조금 327028-09 (A. K. M) 및 238562 (P. E. J.)에 의해 지원 되었다.

1. 샘플 준비
<ol><li>원하는 biomolecule13정화. 참고:이 프로토콜 사용 하 여 구입 코카인 바인딩 DNA aptamer MN4 세 번 뒤 3 kDa 분자량 차단 막으로 원심 필터를 사용 하 여 이온된 수의 3 라운드 2 M NaCl에 대 한 교환 후.</li>
	<li>합성 및 정화, 또는 원하는 thermolabile ligand13를 구입. 참고: MN4 thermolabile ligand 코카인을 바인딩합니다. MN4 또한 이러한 실험 온도에서 ligand th...

<ol>
	<li>Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+in+life+science:+thermodynamics,+stability,+molecular+recognition+and+application+in+drug+design.">Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.</a> Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).</li><li>Privalov, P. L., Dragan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetry+of+biological+macromolecules.">Microcalorimetry of biological macromolecules.</a> Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).</li><li>Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+strong+to+ultratight+protein+interactions+using+differential+scanning+calorimetry.">Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry.</a> Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).</li><li>Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+characterization+of+folding+and+binding+interactions+with+thermolabile+ligands+by+DSC.">Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC.</a> Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).</li><li>Garbett, N. C., Chaires, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+studies+for+drug+design+and+screening.">Thermodynamic studies for drug design and screening.</a> Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).</li><li>Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+binding+thermodynamics+in+drug+discovery.">Measurements of binding thermodynamics in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).</li><li>Plotnikov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions.">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li><li>Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics-based+drug+design:+strategies+for+inhibiting+protein-protein+interactions.">Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions.</a> Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).</li><li>Peri&#225;nez Parraga, L., G-L, A., Gam&#243;n Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado S&#225;nchez, O., Puigvent&#243;s Latorre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolabile+Drugs.+Operating+Procedure+In+the+Event+of+Cold+Chain+Failure.">Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure.</a> Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).</li><li>Murray, J. B., Alshora, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+Cocaine+in+Aqueous-Solution.">Stability of Cocaine in Aqueous-Solution.</a> J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).</li><li>Waterman, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+in+pharmaceutical+formulations.">Hydrolysis in pharmaceutical formulations.</a> Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).</li><li>Mergny, J. L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thermal+melting+curves.">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li><li>Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , 45-128 (1986).</li><li>Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomenological+partial-specific+volumes+for+G-quadruplex+DNAs.">Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs.</a> Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).</li><li>Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Protein+Folding+Cooperativity+by+Differential+Scanning+Calorimetry+and+NMR+Spectroscopy.">Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy.</a> J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).</li><li>Reinstein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinine+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.+Thermodynamic+and+hydrodynamic+analysis+of+high-affinity+binding+of+an+off-target+ligand.">Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand.</a> Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).</li><li>Tellinghuisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+error+propagation.">Statistical error propagation.</a> J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).</li><li>Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+thermodynamic+analysis+of+reversible+unfolding+processes.">Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes.</a> J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).</li></ol>

수정 및 문제 해결
그림 1 그림 2 에 사용 되는 글로벌 피팅 분석의 세부 되었습니다4위에서 설명한. 여기, 우리가 수행 하 고 thermolabile ligands와 DSC 바인딩 실험 분석의 실용적인 측면을 설명 합니다. DSC 기준선에 혼자 thermolabile ligand는 ligand에서 뺍니다 얻은 주의 + biomolecule dataset, 효과적으로 또는 열 변...

차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC) quantitating 바이오 바인딩 및 접는 상호 작용1,2,3에 대 한 강력한 방법입니다. DSC의 강점 바인딩 및 접는 메커니즘, 명료 하 고 해당 열역학 매개 변수2,3를 생성 하는 능력을 포함 합니다. 또한, DSC 솔루션 근처 생리 적 조건 하에서 수행할 수 있습니다 그리고는 biomolecule 또는 ligand, 예를 들어, fluorophores, 스핀-레이블 또는 핵 동위4의 라벨 필요 하지 않습니다. 악기는 존재에 ligand의 부재는 biomolecule 변성 하는 데 필요한 열의 양을 측정 온도 검색 합니다. 결과 thermograms ligand 바인딩 및 프로세스를 접는 통치 열역학 매개 변수를 추출 하는 데 사용 됩니다. DSC 또는 다른 열역학 기술을 제공 하는 정보가 쓰이므로1,5,6,,78을 대상으로 약물의 디자인 지도 중요 합니다. 그러나, 높은 온도에 반복 검사 (~ 60-100 ° C) 문제가 될 수 있습니다. 예를 들어 많은 약물 중요 한 화합물 받아야 재배치 또는 높은 온도9,,1011, 즉지속적인된 노출 시 분해, 그들은 thermolabile. DSC에 의해 상호 작용을 일반적으로 바인딩 시험 열역학 분석12열상의 재현성을 확인 하려면 여러 개의 앞으로 역 검사를 필요 합니다. 초기 ligand의 농도 감소 하면서 각 검색 이후 변경 된 바인딩 특성을 가진 보조 형태로 초기 ligand의 열 변환 형태와 연속 thermograms의 위치에서 발음된 차이에 리드는 열 변환 제품 축적. 이러한 데이터 세트는 전통적인 분석 의무가 없습니다.
우리는 최근 열역학 매개 변수 바이오 접는 통치 및 바인딩 참조는 단일 ligand 바인딩 실험에서 상호 작용의 완전 한 집합을 생성 하는 thermolabile ligand DSC 데이터 집합에 대 한 글로벌 피팅 방법 개발에 무료 biomolecule4에 대 한 필요한 열상. 분석에 필요한 샘플 및 실험 시간 감소 ~ 표준 DSC 접근 방식에 비해 10 배. 우리가 차지 하 고 이것을 가정 하 여 열 변환은 열상 ligand 농도에 의존 하지 않는 각 스캔의 고온 부분 중 발생 하는 리간드에 대 한. 따라서, ligand 농도 열상 열역학 매개 변수를 추출 하는 데 사용 되는의 부분 내에서 상수 이다. 우리는 또한 어떻게 ligand 열 변환에 대 한 속도 상수 장기간 높은 온도 평형 한 보충 실험을 수행 하 여 얻어질 수 있다 설명 했다. Ligand 열 변환 덜 온도 따른 시스템에 대 한 (즉, 모든 온도에서 분명 발생), 분석 변수 ligand 농도 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 여기 우리 DNA aptamer MN4 benzoylecgonine 높은 온도에서 빠르게 변환 thermolabile ligand 코카인의 존재에 대 한이 절차 설명 (> 60 ° C). 말라리아 이후 이러한 실험적인 온도에서 변환 받아야 하지 않습니다 또한 MN4 바인딩 ligand thermolability에 대 한 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다. 우리는 thermolabile ligand DSC 데이터 집합 및 그들의 분석 저조한 접는, 바인딩 및 리간드의 열역학 및 운동 매개 변수 변환 프로세스의 인수를 설명 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chem Impex</td>
			<td>#00829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deioinized water for molecular biology</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>H20MB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 micron sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA28145-477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 kDa centrifugal filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>131048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89068-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic DSC flange caps</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>6111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA aptamer MN4</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>22620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDSC-III microcalorimeter</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSCRun software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAnalyze software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contrad-70</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89233-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions

차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC) 바이오 폴딩 및 바인딩 상호 작용을 경 세 하는 열역학 매개 변수 측정을 위한 강력한 기술입니다. 이 정보는 새로운 약 제 화합물의 설계에 중요 합니다. 그러나, 많은 약물 관련 ligands 않습니다 화학적으로 안정 된 DSC 분석에 사용 된 높은 온도에. 따라서, 바인딩 상호 작용을 측정 ligands 및 열 변환 제품의 농도 열 셀 내에서 끊임없이 변화 하기 때문에 도전 이다. 여기, 우리 thermolabile ligands 및 DSC를 사용 하 여 빠르게 변환 프로세스 접는, 바인딩 및 리간드에 열역학 및 운동 정보를 얻기 위해 프로토콜을 제시. 우리는 DNA aptamer MN4 thermolabile ligand 코카인을를 우리의 메서드를 적용 했습니다. 계정에 thermolabile ligand 변환에 대 한 새로운 글로벌 피팅 분석을 사용 하 여 매개 변수 바인딩 및 접는의 완전 한 세트 DSC 실험의 쌍에서 가져옵니다. 또한, 우리는 하나의 보조 DSC 데이터 집합으로 thermolabile ligand 변환에 대 한 속도 상수를 얻을 수 있습니다 보여줍니다. 식별 하 고 몇 가지 더 복잡 한 시나리오에서 데이터 분석에 대 한 지침, biomolecule, 천천히 접는, 느린 바인딩 및 thermolabile ligand의 급속 한 소모의 돌이킬 수 없는 집계를 포함 하 여 제공 됩니다.

Thermolabile ligand 기무사에 대 한 대표적인 데이터는 그림 1에 나와 있습니다. 위치 및 thermolabile ligand 바인딩 피크의 높이 연속적으로 이동 언바운드 biomolecule 그쪽으로 thermolabile ligand 각 스캔 (그림 1a)와 고갈로 합니다. 무료 변성 프로필 thermolabile ligand 변환 (그림 1b)의 끝점에 대 한 참조로 사용 됩니다. MN4 ?...

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Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

선물이 바이오 폴딩 및 바인딩 차동 스캐닝 열 량 측정을 사용 하 여 thermolabile ligands와의 상호 작용의 신속한 특성화에 대 한 프로토콜.

바이오 DSC 프로필 Thermolabile Ligands 빠르게 폴딩 및 바인딩 상호 작용의 특성을 측정

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

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지질 결합 단백질및 알레르겐에서 내인성 리간드의 제거 및 교체

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...