Name: measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions
Uploaded: 2017-11-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions at JoVE.com

R. W. H. V был поддержан МакГилл естественных наук и инженерных исследований Совет Канады (СЕНТИ) программа обучения в Bionanomachines. А. к. м. и P. E. J. были поддержаны Сенти грантов 327028-09 (A. K. М) и 238562 (P. E. J.).

1. Пробоподготовка
<ol><li>Очищайте желаемого биомолекулы13. Примечание: Этот протокол использует приобретенные кокаина связывания ДНК aptamer MN4 после обмена против 2 М NaCl, три раза после трех раундов деионизованной воды с помощью центробежного фильтра с мембраной отсечения мо...

<ol>
	<li>Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+scanning+calorimetry+in+life+science:+thermodynamics,+stability,+molecular+recognition+and+application+in+drug+design.">Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design.</a> Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).</li><li>Privalov, P. L., Dragan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcalorimetry+of+biological+macromolecules.">Microcalorimetry of biological macromolecules.</a> Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).</li><li>Brandts, J. F., Lin, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+strong+to+ultratight+protein+interactions+using+differential+scanning+calorimetry.">Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry.</a> Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).</li><li>Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+characterization+of+folding+and+binding+interactions+with+thermolabile+ligands+by+DSC.">Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC.</a> Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).</li><li>Garbett, N. C., Chaires, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+studies+for+drug+design+and+screening.">Thermodynamic studies for drug design and screening.</a> Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).</li><li>Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurements+of+binding+thermodynamics+in+drug+discovery.">Measurements of binding thermodynamics in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).</li><li>Plotnikov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+autosampling+differential+scanning+calorimeter+instrument+for+studying+molecular+interactions.">An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions.</a> Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).</li><li>Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamics-based+drug+design:+strategies+for+inhibiting+protein-protein+interactions.">Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions.</a> Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).</li><li>Peri&#225;nez Parraga, L., G-L, A., Gam&#243;n Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado S&#225;nchez, O., Puigvent&#243;s Latorre, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermolabile+Drugs.+Operating+Procedure+In+the+Event+of+Cold+Chain+Failure.">Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure.</a> Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).</li><li>Murray, J. B., Alshora, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stability+of+Cocaine+in+Aqueous-Solution.">Stability of Cocaine in Aqueous-Solution.</a> J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).</li><li>Waterman, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrolysis+in+pharmaceutical+formulations.">Hydrolysis in pharmaceutical formulations.</a> Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).</li><li>Mergny, J. L., Lacroix, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+thermal+melting+curves.">Analysis of thermal melting curves.</a> Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).</li><li>Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+a+stem+length-dependent+binding+mechanism+for+the+cocaine-binding+aptamer.+A+combined+NMR+and+calorimetry+study.">Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study.</a> Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).</li><li>Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+electrophoretic+and+hydrodynamic+properties+of+DNA+and+RNA+oligonucleotide+duplexes.">Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes.</a> Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).</li><li>Durchschlag, H., Hinz, H. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3.">Chapter 3.</a> Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , 45-128 (1986).</li><li>Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phenomenological+partial-specific+volumes+for+G-quadruplex+DNAs.">Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs.</a> Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).</li><li>Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Protein+Folding+Cooperativity+by+Differential+Scanning+Calorimetry+and+NMR+Spectroscopy.">Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy.</a> J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).</li><li>Reinstein, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quinine+binding+by+the+cocaine-binding+aptamer.+Thermodynamic+and+hydrodynamic+analysis+of+high-affinity+binding+of+an+off-target+ligand.">Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand.</a> Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).</li><li>Tellinghuisen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+error+propagation.">Statistical error propagation.</a> J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).</li><li>Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+thermodynamic+analysis+of+reversible+unfolding+processes.">Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes.</a> J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).</li></ol>

Модификации и устранение неполадок
Данные анализа глобальной установки, используемых в Рисунок 1 и 2 были описаны ранее4. Здесь мы приводим практические аспекты выполнения и анализа ДСК привязки эксперименты с термол...

Дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК)-это мощный метод для quantitating биомолекулярных привязки и складной взаимодействия1,2,3. Сильные ДСК включают способность для уточнения привязки и складные механизмы и давать соответствующие термодинамических параметров2,3. Кроме того DSC может быть выполнена в растворе рядом физиологических условиях и не требует маркировки биомолекулы или лиганд, например, с флуорофоров, спин этикетки или ядерные изотопы4. Инструмент сканирует температуры, измерять количество тепла, необходимое чтобы денатурировать биомолекулы в присутствии и отсутствии лиганда. Результате термограммы используются для извлечения термодинамических параметров, управляющих лигандом привязки и складывающиеся процессов. Информацию, представленную ДСК или других термодинамических методов имеет решающее значение для руководства дизайн наркотиков ориентации биомолекул1,5,6,,78. Однако повторное сканирование для высоких температур (~ 60-100 ° C) может быть проблематичным. Например многие фармацевтически важных соединений проходят перегруппировки или разложение после устойчивого воздействия высокой температуры9,10,11, т.е., они термолабильных. Экспертиза привязки взаимодействия, DSC, обычно требует несколько вперед и обратного сканирования для проверки воспроизводимости термограммы термодинамический анализ12. Термический первоначального лигандом для вторичной формой с характеристиками измененной привязки приводит к заметными различиями в форму и положение последовательных термограммы, так как концентрация первоначального лигандом уменьшается с каждой проверки во время Термический продуктов накапливаются. Эти наборы данных не поддаются традиционным анализом.
Мы недавно разработали метод глобальные установки для термолабильных лигандом DSC наборов данных, что дает полный набор термодинамических параметров регулирующих биомолекулярных складывания и привязки взаимодействия от одного лиганд прыгните эксперимент, связанный с требуемой термограммы для свободного биомолекулы4. Анализ уменьшает время экспериментальных и образец требует ~ 10 раз по сравнению с стандартным DSC подходов. Мы составили для лигандом термический, предполагая, что это происходит во время высокой температуры часть каждого сканирования, где термограммы не зависит от концентрации лиганда. Таким образом концентрация лиганд — константа, в части термограммы, который используется для извлечения термодинамических параметров. Дополнительно мы продемонстрировали, как константа скорости лигандом термический можно получить, выполнив один дополнительный эксперимент с более длительный период уравновешивания высокой температуры. Для систем, где лигандом термический менее зависит от температуры (т.е., в значительной степени происходит при всех температурах), анализ может быть изменен для включения переменной лигандом концентрации. Здесь мы показываем эту процедуру для ДНК aptamer MN4 присутствии термолабильных лигандом кокаина, который быстро преобразует бензилэкгоин при высоких температурах (> 60 ° C). Хинин используется как отрицательный контроль для лигандом thermolability, поскольку она не претерпела преобразования при этих температурах экспериментально и также связывает MN4. Мы описываем приобретение термолабильных лигандом DSC наборов данных и их анализа, уступая термодинамические и кинетические параметры складывания, привязки и лигандом процессов преобразования.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Chem Impex</td>
			<td>#00829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic dihydrate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>71502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deioinized water for molecular biology</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>H20MB1001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 micron sterile syringe filters</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CA28145-477</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 kDa centrifugal filters</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>131048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89068-474</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic DSC flange caps</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>6111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA aptamer MN4</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td>https://www.idtdna.com/site/order/menu</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cocaine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quinine</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>22620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDSC-III microcalorimeter</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/nanodsc/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DSCRun software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoAnalyze software</td>
			<td>TA Instruments</td>
			<td>http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Contrad-70</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89233-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring biomolecular dsc profiles with thermolabile ligands to rapidly characterize folding and binding interactions

Дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) – это мощный метод для количественной оценки термодинамических параметров, регулирующих биомолекулярных складывания и привязки взаимодействия. Эта информация имеет решающее значение в разработке новых фармацевтических соединений. Однако многие фармацевтически соответствующих лигандов являются химически неустойчивыми при высоких температурах, используемых в ДСК анализов. Таким образом измерения привязки взаимодействия сложным, потому что концентраций лигандов и термически преобразованы продукции постоянно меняются в ячейке калориметра. Здесь мы представляем протокол, с помощью термолабильных лигандов и ДСК для быстрого получения термодинамические и кинетические информации о складывания, привязки и лигандом процессов преобразования. Мы применили метод к ДНК aptamer MN4, которая связывает термолабильных лигандом кокаина. С помощью новой глобальной установки анализа, который приходится термолабильных лигандом преобразования, полный набор складывания и привязки параметров получаются из пару DSC экспериментов. Кроме того мы показываем, что константа скорости термолабильных лигандом преобразования могут быть получены с только один дополнительный набор DSC. Представлены руководящие принципы выявления и анализа данных из нескольких более сложных сценариев, включая необратимой агрегации биомолекулы, медленно складывающиеся, медленно привязки, и быстрое истощение запасов термолабильных лиганда.

Репрезентативных данных для термолабильных лигандом DSC показаны на рисунке 1. Положение и высоту термолабильных пик лиганд прыгните последовательно сдвигает вниз к что несвязанных биомолекулы как обедненный термолабильных лиганда с каждого сканиров...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions at JoVE.com

Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions

Мы представляем собой протокол для быстрого характеристика биомолекулярных складывания и привязки взаимодействия с термолабильных лигандов с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии.

Измерения биомолекулярных DSC профили с термолабильных лигандами быстро характеризовать складывания и привязки взаимодействия

Differential scanning calorimetry (DSC) is a powerful technique for quantifying thermodynamic parameters governing biomolecular folding and binding ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Времяразрешенная ионизацией электрораспылением водорода дейтерий Обмен масс-спектрометрии для изучения белка структуры и динамики

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

Измерение сигнальной связи рецептора с G-белком с помощью радиомаркированного связывания GTP

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Измерение связывания белка с F-актином путем совместного осаждения

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Обнаружение малых ГТФазы Prenylation и GTP привязки с помощью мембраны фракционирования и ГТФазы-Assay иммуносорбента

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR) and Microscale Thermophoresis (MST)

Measuring Interactions of Globular and Filamentous Proteins by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR and Microscale Thermophoresis MST

Измерения взаимодействий шаровых и волокнистых белков спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) и микромасштабной Thermophoresis (MST)

Filamentous proteins such as vimentin provide organization within cells by providing a structural scaffold with sites that bind proteins containing plakin ...

Interactions with and Membrane Permeabilization of Brain Mitochondria by Amyloid Fibrils

Взаимодействие с и Мембрана Пермябилизация митохондрий мозга амилоида Фибрилс

A growing body of evidence indicates that membrane permeabilization, including internal membranes such as mitochondria, is a common feature and primary ...

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

Измерение взаимодействия между флуоресцентными зондами и лигнином в секциях растений sFLIM на основе автофлюоресценции коренных народов

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

A Rapidly Incremented Tethered-Swimming Maximal Protocol for Cardiorespiratory Assessment of Swimmers

Быстро приращенный привязной плавания Максимальный протокол для кардиореспираторной оценки пловцов

Incremental exercise testing is the standard means of assessing cardiorespiratory capacity of endurance athletes. While the maximal rate of oxygen ...

Measuring Nucleotide Binding to Intact, Functional Membrane Proteins in Real Time

Измерение связывания нуклеотидов с интактными функциональными мембранными белками в режиме реального времени

We have developed a method to measure binding of adenine nucleotides to intact, functional transmembrane receptors in a cellular or membrane environment. ...

Removal and Replacement of Endogenous Ligands from Lipid-Bound Proteins and Allergens

Удаление и замена эндогенных лигандов из липид-связанных белков и аллергенов

Many major allergens bind to hydrophobic lipid-like molecules, including Mus m 1, Bet v 1, Der p 2, and Fel d 1. These ligands are strongly retained and ...