Name: automated analysis of a nematode population-based chemosensory preference assay
Uploaded: 2017-07-13T14:00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay at JoVE.com

Nogle stammer blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center (CGC), som finansieres af NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Dette arbejde støttes af Howard Hughes Medical Institute, hvor PWS er ​​en efterforsker.

<ol>
	<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314, 1-340 (1986).</li><li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans.">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li><li>Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+responds+to+chemical+repellents+by+integrating+sensory+inputs+from+the+head+and+the+tail.">C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail.</a> Curr Biol. 12 (9), 730-734 (2002).</li><li>Hilliard, M. A., Bergamasco, C., Arbucci, S., Plasterk, R. H., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+taste+bitter:+ASH+neurons,+QUI-1,+GPA-3+and+ODR-3+mediate+quinine+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms taste bitter: ASH neurons, QUI-1, GPA-3 and ODR-3 mediate quinine avoidance in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO J. 23 (5), 1101-1111 (2004).</li><li>Zariwala, H. A., Miller, A. C., Faumont, S., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step+response+analysis+of+thermotaxis+in+Caenorhabditis+elegans.">Step response analysis of thermotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 23 (10), 4369-4377 (2003).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (3), 817-821 (1973).</li><li>Wicks, S. R., de Vries, C. J., van Luenen, H. G., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHE-3,+a+cytosolic+dynein+heavy+chain,+is+required+for+sensory+cilia+structure+and+function+in+Caenorhabditis+elegans.">CHE-3, a cytosolic dynein heavy chain, is required for sensory cilia structure and function in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 221 (2), 295-307 (2000).</li><li>Jansen, G., Weinkove, D., Plasterk, R. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+subunit+gpc-1+of+the+nematode+C.+elegans+is+involved+in+taste+adaptation.">The G-protein subunit gpc-1 of the nematode C. elegans is involved in taste adaptation.</a> EMBO J. 21 (5), 986-994 (2002).</li><li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans.">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li><li>Choe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascaroside+signaling+is+widely+conserved+among+nematodes.">Ascaroside signaling is widely conserved among nematodes.</a> Curr Biol. 22 (9), 772-780 (2012).</li><li>Ezcurra, M., Tanizawa, Y., Swoboda, P., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+sensitizes+C.+elegans+avoidance+behaviours+through+acute+dopamine+signalling.">Food sensitizes C. elegans avoidance behaviours through acute dopamine signalling.</a> EMBO J. 30 (6), 1110-1122 (2011).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nat Neurosci. 11 (8), 916-922 (2008).</li><li>Kunitomo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+memory-dependent+synaptic+plasticity+of+a+taste+circuit+regulates+salt+concentration+chemotaxis+in+Caenorhabditis+elegans.">Concentration memory-dependent synaptic plasticity of a taste circuit regulates salt concentration chemotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Commun. 4, 2210 (2013).</li><li>Snow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons.">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).</li><li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+expression+of+TRPV+channel+proteins+defines+their+sensory+functions+and+subcellular+localization+in+C.+elegans+neurons.">Combinatorial expression of TRPV channel proteins defines their sensory functions and subcellular localization in C. elegans neurons.</a> Neuron. 35 (2), 307-318 (2002).</li><li>Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+alternative+behavioral+states+by+serotonin+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans.</a> Neuron. 21 (1), 203-214 (1998).</li><li>Sawin, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans. , (1996).</li><li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parallel+worm+tracker:+A+platform+for+measuring+average+speed+and+drug-induced+paralysis+in+nematodes.">The parallel worm tracker: A platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes.</a> PLoS One. 3 (5), e2208 (2008).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans.">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat Methods. 8 (7), 592-598 (2011).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Et kritisk trin i protokollen sikrer, at assaypladerne har en ensartet tørhedsgrad over forskellige eksperimentelle dage. Forskellige tørhedsniveauer vil resultere i forskellige diffusionshastigheder af opløsningen i agar og følgelig variationer i adfærdsmæssigt udfald. Analyseplader skal således altid laves frisk om eftermiddagen før forsøg. Antallet af orme testet pr. Test bør også reguleres for at lette sammenligningen mellem behandlinger. Til reference ligger en vildtypeorm 4-10 æg / h i gennemsnit, der giver&gt; 360 orme pr. Assay, hvis ormsynkroniseringsprotokollen ovenfor følges 17 . Hvis visse mutante stammer er æglægning defekte, skal du vælge flere gravide voksne orme til æglægning for at nå målantalet afkom. Et andet vigtigt skridt i protokollen er at håndtere orme forsigtigt under vaskeprocessen og ormen placering. Orme er følsomme over for mekaniske stimuli, som fremkalder stressresponser sådan<html> S reverseringer og æglægningshæmning 18 . Derudover bør man være opmærksom på at definere ROI nøjagtigt og for at bestemme den optimale tærskelkonstantværdi for specifikke lysforhold, før man fortsætter med videoanalysen. Det anbefales også at kalibrering og tærskelprocesserne gentages, hvis der er gået en længere periode siden det sidste forsøg blev kørt. En begrænsning af denne metode er, at den ikke er egnet til at analysere små ormpopulationer. Men hvis de relevante kontroller til bestemmelse af indflydelsen af ​​tilstedeværelsen af ​​mad på den sensoriske adfærd udføres, er det også muligt at anvende mad til at begrænse ormernes rumlige udforskningssted som i retensionsassayet med denne opsætning. Desuden er denne metode ikke beregnet til at studere stimulusgradientnavigation på grund af nærheden og små mængder af de anvendte kontrol- og forsøgsløsninger. E_content &quot;&gt; I fremtiden kan programmeringssoftware, der muliggør udnyttelse af multi-orm og single-worm-ekstraktion, integreres i dette system 19 , 20. Optagelse af subtile adfærdsparametre for enkeltorms adfærd som omdrejningshastigheder og amplitude af kropsbøjninger vil tilvejebringe Et mere detaljeret billede af en individuel orms kemosensoriske opførsel i sammenhæng med et populationbaseret assay. Analysen kan også modificeres for at studere habituation ved at køre huller gennem afkastet ved hjælp af sprøjtenåle med passende måleformat og fylde hullerne med agar infunderet Med forsøgsforbindelsen eller kontrolpufferen. Dette vil sikre en mere konsistent overfladekoncentration af forbindelsen over en længere periode af optagetid, som det er nødvendigt under forsøgsforsøg. En anden potentiel anvendelse af denne metode er at gennemføre sammenlignende adfærdsstudier på tværs af forskellige nematodarter. Hertil kommer adfærdskammeretKan modificeres på flere måder til at studere adfærdsmæssige reaktioner på multimodale stimuli. Til optogenetiske applikationer kan højintensitets LED-arrays fastgøres ved siden af ​​kameraholderen for selektivt at aktivere neuroner af interesse under analysen. Varmeelementer, kølesystemer og temperatursensorer kan også tilføjes til opsætningen for at studere temperaturens virkninger på sensoriske opførsel. Desuden kan lugtleveringssystemer installeres inde i kammeret for at undersøge interaktioner mellem lugt- og kemosensoriske modaliteter.

Foraging dyr skal integrere input fra flere sensoriske modaliteter og vælge passende adfærdsmæssige strategier for at kunne navigere deres miljø. Forståelse af hvordan eksterne sensoriske indgange modtages og transduceres til neurale informationer til at styre actionvalg er et centralt mål inden for neurobiologi. Den genetisk trækkelige nematode, C. elegans , er en attraktiv modelorganisme, hvor man studerer de neurale mekanismer, der ligger til grund for sensorisk biologi og multimodal integration. Selvom C. elegans kun har 302 neuroner, kan den opdage og diskriminere mellem en lang række miljømæssige stimuli, herunder opløselige forbindelser, flygtige lugtstoffer og omgivelsestemperatur 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . DetNematode C. elegans er stærkt afhængig af dets kemosensoriske apparat for at lokalisere fødekilder og til at advare sig mod potentielle trusler. Således spiller adfærdsmæssige analyser, der er designet til at screene svarene fra vildtype og mutant C. elegans til kemiske stimuli, en afgørende rolle i dissekere de genetiske, cellulære og neurale mekanismer, der ligger til grund for C. elegans bemærkelsesværdige sensoriske evner. For at analysere responset på opløselige forbindelser er der beskrevet tre typer af assays - drop testen, chemotaxis assayet og retention assayet. I drop-testen placeres en lille dråbe af forbindelsen i en bevægelsesorms hale, og ormens beslutning om at vende om eller bevæge sig fremad, når væsken når det fremre sensoriske apparat, er scoret 4 . Drop testen kræver lidt eksperimentelt forberedelse og er nyttigt, når ormestørrelsen er lille, som i tilfældet med laserdrevne orme. Men som kun en ormKan analyseres ad gangen, og eksperimentatoren skal være til stede i løbet af analysens varighed, kan dråptesten være tidskrævende. Drop testen er også sårbar over for variationer i drop levering mellem hver orm i en prøve, hvilket kan påvirke de samlede resultater af analysen. En anden begrænsning af drop testen er, at den kun kan bruges til at analysere ormens reaktion på aversive forbindelser, da det ikke er muligt at diskriminere mellem en attraktiv eller neutral virkning af forbindelsen fra ormens fremadrettede bevægelse. Chemotaxis-analysen for opløselige forbindelser indebærer generelt at dele en agarplade i fire kvadranter, idet den eksperimentelle opløsning blandes i agaret af to modstående kvadranter, og kontrolopløsningen blandes i de andre to kvadranter 8 , 9 . Ved analysens begyndelse placeres en dråbe buffer indeholdende orme i midten af ​​pladen og antallet af orme i<html> Hver kvadrant bliver scoret på forskellige tidspunkter. Chemotaxis-analysen giver større statistisk effekt sammenlignet med drop testen, da et stort antal orme testes i hvert assay. En begrænsning af denne metode er imidlertid, at fremstilling af chemotaxis-assaypladerne kræver store mængder af forsøgsforbindelsen. Dette vil gøre det vanskeligt at udføre storskala adfærdskanaler, hvis en kompliceret rensningsproces med begrænsede udbytter er påkrævet for at opnå den ønskede forbindelse, som i tilfældet med ascarosid-signalmolekylerne 10 . Derudover er manuel tælling af orme gennem analysen modtagelig for fejl, og pladens forstyrrelse under tællingsprocessen kan påvirke resultaterne. I modsætning til de to ovennævnte fremgangsmåder udnytter retensionsassayet maskinsyn, som minimerer fejl under scoreprocessen og reducerer eksperimentatorens interferens under analysen<html> &gt; 11. Computeriseret analyse af videooptagelser af ormadfærd kan også potentielt afsløre subtile adfærdsmønstre, som vil blive savnet, når scoring kun udføres på et par diskrete tidspunkter. I retentionsassayet tilsættes to opløsningspletter på modsatte sider af en lille cirkulær bakteriel fødeplaster efterfulgt af placeringen af ​​et lille antal orme i midten af ​​fødeplaster. Ormenes adfærd registreres derefter, analyseres, og en præferenceindeksværdi beregnes ud fra det samlede antal ormpixel i hver opløsningsregion. Skønt tilstedeværelsen af ​​et attraktivt fødepatch gør det muligt at anvende mindre populationer af orme i hvert assay, har fødevarer tidligere vist sig at sensibilisere undvikelsesadfærd til opløselige repellanter 12 . Desuden udviser orme et fotofob svar på kortbølgelængde lys, og brugen af ​​mikroskop lyskilder, der udsender hvidt lys i opførelsen af ​​optagelsesoptagelsen, kan påvirke adfærdS = &quot;xref&quot;&gt; 13. Formålet med metoden, der er diskuteret i denne artikel, er at registrere og analysere C. elegans &#39; præference for opløselige forbindelser under anvendelse af en populationsbaseret analyse. Til dette formål integrerer og forbedrer den nuværende metode aspekter fra alle tre af de tidligere diskuterede metoder. Det gør det muligt at teste store populationer af orme og kræver kun små mængder af den eksperimentelle opløsning, som skal anvendes i hvert assay. Desuden udføres analysen inden for et specialbygget lukket adfærdskammer med infrarød LED-baggrundsbelysning for at minimere virkningerne af kortbølgelængde lys på adfærd. Hvert kammer kan også udstyres med flere mikroskopkameraer, hvilket øger eksperimentelt gennemløb uden at gå på kompromis med bænkplads. Endelig udsender videoanalyseprogrammet præferenceindeksværdien for hver video samt et ledsagende ormbelægningsplan for at visualisere befolkningsadfærdsdynamikken over tid. Kammeropsætningen og aSsay-protokollen kan modificeres yderligere for at studere multimodale adfærdsmæssige reaktioner, såsom virkningen af ​​lugtstoffer eller temperatur på kemosensoriske adfærd. Denne artikel beskriver opførelsen af ​​adfærdskammeret og analyseprotokollen. Det demonstrerer også anvendeligheden af ​​denne fremgangsmåde ved at analysere responsen af ​​vildtype-orme og kemosensoriske defekte mutanter til det kendte opløselige afstødningsmiddel, kobberioner 4 . Endelig er videoanalyseprocessen ved hjælp af den medfølgende software detaljeret.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Aluminum T-slotted framing extrusions</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">47065T101</td>
			<td style="width:359px;">Single profile, 1&#34; size, solid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brackets</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T236</td>
			<td>1&#34; long for 1&#34; high single profile extrusions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Compact end-feed fasteners</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T139</td>
			<td>1&#34; (single), pack of 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Twist-in solid panel holders</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T251</td>
			<td>For 1&#34; high extrusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic end caps</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T91</td>
			<td>For 1&#34; high extrusion</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Optically clear cast acrylic sheet</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">8560K211</td>
			<td>3/16&#34; thick, 12&#34; x 12&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinyl-coated polyester fabric</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">88505K57</td>
			<td>0.027&#34; thick, 61&#34; width, black</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brass grommets</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>9604K22</td>
			<td>Trade size 0, 0.545&#34; outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Steel washers</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>90107A029</td>
			<td>1/4&#34; screw size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rounded head screws</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>90272A546</td>
			<td>1/4&#34;-20 thread size, 1-1/2&#34; long</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Standard operating backlight</td>
			<td style="width:147px;">Smart Vision Lights</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td>8&#34;x8&#34;, infrared 850nm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">IVP-C1 Variable Control Pot</td>
			<td style="width:147px;">Smart Vision Lights</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">T1 Power Supply</td>
			<td style="width:147px;">Smart Vision Lights</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Dino lite Pro AM4113T</td>
			<td style="width:147px;">Dino-Lite Digital Microscope</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">MS09B microscope stand</td>
			<td style="width:147px;">Dino-Lite Digital Microscope</td>
			<td>See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated analysis of a nematode population-based chemosensory preference assay

Den nematode, Caenorhabditis elegans &#39;kompakte nervesystem af kun 302 neuroner ligger under et varieret repertoire af adfærd. For at lette dissektionen af ​​de neurale kredsløb, der ligger til grund for disse adfærd, er udviklingen af ​​robuste og reproducerbare adfærdsmæssige analyser nødvendig. Tidligere C. elegans adfærdsmæssige undersøgelser har anvendt variationer af en &quot;drop test&quot;, et &quot;chemotaxis assay&quot; og et &quot;retention assay&quot; for at undersøge C. elegans reaktion på opløselige forbindelser. Fremgangsmåden beskrevet i denne artikel søger at kombinere de komplementære styrker af de tre ovennævnte analyser. Kort fortalt er en lille cirkel midt på hver analyseplade opdelt i fire kvadranter med kontrol og eksperimentelle løsninger skiftevis placeret. Efter tilsætningen af ​​ormene er assaypladerne indlæst i et adfærdskammer, hvor mikroskopkameraer registrerer ormernes møder med de behandlede områder. Automatiseret videoanalyse udføres derefter aNd en præferenceindeks (PI) værdi for hver video genereres. Videooptagelses- og automatiserede analysegenskaber ved denne metode minimerer eksperimentets involvering og eventuelle tilknyttede fejl. Endvidere anvendes små mængder af forsøgsforbindelsen pr. Assay, og adfærdskammerets multikameraopsætning øger eksperimentelt gennemløb. Denne metode er særlig nyttig til at udføre adfærdsmæssige skærmbilleder af genetiske mutanter og nye kemiske forbindelser. Denne metode er imidlertid ikke hensigtsmæssig til undersøgelse af stimulusgradientnavigering på grund af nærhed af kontrol- og eksperimentelle opløsningsområder. Det bør heller ikke bruges, når kun en lille population af orme er til rådighed. Selvom det kun er egnet til at analysere responser kun på opløselige forbindelser i sin nuværende form, kan denne metode let ændres til at rumme multimodal sensorisk interaktion og optogenetiske undersøgelser. Denne metode kan også tilpasses til at analysere de kemosensoriske responser af andre nematod-arter. </p&gt;

Figur 3A viser præferenceindeksværdierne opnået for forskellige genotype- og behandlingsparringer. En præferenceindeksværdi på 1 angiver stærk attraktion for løsningen placeret i eksperimentelle ROI, mens en præferenceindeksværdi på -1 angiver stærk afstødning. Et præferenceindeks på 0,02 blev opnået, når M13-bufferopløsningen blev anbragt i både kontrol- og eksperimentelle ROI&#39;er, hvilket demonstrerede, at der ikke er nogen rumlig bias mod enten ROI. N2 orme undgik stærkt kobberionerne, hvilket resulterede i et præferenceindeks på -0,67, hvilket bekræfter tidligere konstateringer, at kobberioner er en stærk repellant ( Supplementary Movie 1 ) 4 . Osm-3- mutanter, som mangler korrekt dannelse af de distale segmenter af sensoriske cilia, viste en signifikant nedsat undgåelse af kobberioner (PI = -0,19) 15 . Ocr-2 mutanter, som er de<html> Fektive i mange ASH-medierede nociceptive responser, herunder kobberunddragelse, udviser også signifikant nedsat undgåelse og endog en vis mild attraktion for kobberioner (PI = 0,19) ( Supplementary Movie 2 ) 16 . Figur 3B viser repræsentative ormbelægningsgrader, der angiver tyngden af ​​orme i kontrollen versus de eksperimentelle ROI&#39;er over tid i hver video. Jo mørkere farven på plottingsområdet er, desto større er antallet af ormpixel i afkastet. Beboelsesplottet for N2 orme behandlet med M13 buffer kontrol viser, at antallet af orme i begge ROI&#39;er forbliver ens i hele analysen. Imidlertid indikerer belægningsgraven for N2-orme behandlet med kobberioner at ormene stærkt og konsekvent undgår det eksperimentelle ROI i hele analysen. Gimg &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55963 / 55963fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1: Foto og skematisk repræsentation af adfærdskammerdesign. ( A ) Set forfra af opførselskammeropsætning (venstre) og tilsvarende skematisk repræsentation af kammerramme (højre). Uigennemsigtige polyesterplader lukker kammeret på alle ansigter undtagen bundfladen, som giver lys gennem det infrarøde baggrundsbelysningspanel. Numrene 1, 2 og 3 svarer til ekstruderingslaget i (B). ( B ) Skematisk af ovenfra af ekstruderingslag omfattende opførselskammerrammen. Dette omfatter toplaget (1), det midterste kamera mount monteringslag (2) og det nederste trinlag (3). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig2.jpg"/&gt; Figur 2: Løsningsplacering og pladejusteringskabeloner. ( A ) Løsningsplaceringsskabelonen har fire kvadranter og nummerjusteringsmarkører. Kontrolopløsningen placeres i øverste venstre og nederste højre kvadranter, mens den eksperimentelle løsning placeres i øverste højre og venstre venstre kvadranter. ( B ) Pladjusteringsmalen har kun nummerjusteringsmarkører for at minimere okklusion af orme i synsfeltet under videooptagelse og analyse. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig3.jpg" /> Figur 3: Eksempeldata indsamlet ved hjælp af dette assay. ( A ) Præferenceindeks (PI) værdier for vildtype N2 og mutant C. elegans </e<html> m&gt; reaktion på M13-buffer og 10 mM CuCl2. N2 orme viste ingen præference mellem kontrol- og eksperimentelle ROI&#39;er, når M13-kontrolopløsning blev placeret i begge ROI&#39;er, men stærkt undgået det eksperimentelle ROI, når kobberioner blev placeret i den (henholdsvis PI = 0,02 og -0,67). Osm-3 (p802) mutanter og ocr-2 (ak47) mutanter viste signifikant nedsat undgåelse af kobberioner sammenlignet med N2 (PI = -0,1 og 0,2). N = 6 analyser for hver genotypebehandlingsparring,&gt; 360 orme pr. Analyse, fejlstænger indikerer ± 1 SEM, *** p &lt;0,001, envejs ANOVA efterfulgt af post-hoc Tukey Honestly Significant Difference (HSD) test. ( B ) Repræsentative ormbelægninger for N2 orme med M13 buffer i både ROI (top) og N2 orme med M13 buffer i kontrol ROI og kobberioner i eksperimentelle ROI (bund). Farveskalaen under hvert belægningsplot repræsenterer antallet af ormpixel.Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Venligst klik her for at se en større version af denne figur. Supplerende film 1: Adfærdsmæssig reaktion af N2 orme til 10 mM kobberchlorid. Ormer tiltrækkes af kontrolkvadranterne med M13 buffer (øverst til venstre og nederst til højre), men undgå stærkt kvadranterne, der indeholder kobberioner opløst i M13 buffer (øverst til højre og nederst til venstre). Videoen blev optaget til 1 billede pr. Sekund og sped op 15x. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_Video_1.mp4">Klik her for at downloade denne fil.</a> Supplerende film 2: Adfærdsmæssigt svar fra ocr-2 (ak47) orme til 10 mM kobberchlorid. Worms strejfer i omtrent lige stor grad i begge kontrolkvadranterne med M13 buffer (øverst til venstre og nederst til højre) og kvadrantenS indeholdende kobberioner opløst i M13 buffer (øverst til højre og nederst til venstre) i hele registreringsvarigheden. Mutanterne udviser en lille præference for kvadranterne, der indeholder kobberioner ved starten af ​​optagelsen. Videoen blev optaget til 1 billede pr. Sekund og sped op 15x. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_video_2.mp4">Klik her for at downloade denne fil.</a> Supplerende fil: Solution-placement og Plate-alignment skabeloner. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/JoVE_template.pptx">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay at JoVE.com

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

Vi præsenterer en opsætningsopsætning og protokol, der muliggør automatisk analyse af nematoden, Caenorhabditis elegans &#39;præference for opløselige forbindelser i en populationbaseret analyse. Denne artikel beskriver opførelsen af ​​et adfærdskammer, den adfærdsmæssige analyseprotokol og brugen af ​​videoanalyseprogrammer.

Automatiseret analyse af en Nematode Befolkningsbaseret Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

Måling af Fronto-limbiske aktivitet Brug af en følelsesmæssig Oddball Opgave i børn med Familiær høj risiko for skizofreni

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Fat Preference: A Novel Model of Eating Behavior in Rats

Fat præference: A Novel Model af spiseadfærd i rotter

Obesity is a growing problem in the United States of America, with more than a third of the population classified as obese. One factor contributing to ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Eksperimentel Vurdering af Mouse Sociability Brug af en Automatiseret Image Processing Approach

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Assessment of Cocaine-induced Behavioral Sensitization and Conditioned Place Preference in Mice

Vurdering af kokain-induceret Behavioral Sensibilisering og konditioneret Place Preference i mus

It is thought that rewarding experiences with drugs create strong contextual associations and encourage repeated intake. In turn, repeated exposures to ...

Protocol for Data Collection and Analysis Applied to Automated Facial Expression Analysis Technology and Temporal Analysis for Sensory Evaluation

Protokol for Dataindsamling og analyse Anvendt til Automatiseret Facial Expression Analyse Teknologi og Temporal Analyse for Sanse Evaluering

We demonstrate a method for capturing emotional response to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial ...

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

En automatiseret hurtige iterativ Negative Geotaxis analyse til at analysere voksen klatring adfærd i en Drosophila Model af Neurodegeneration

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. ...

Reinstatement of Drug-seeking in Mice Using the Conditioned Place Preference Paradigm

Genindsættelse af stof-søgende i mus ved hjælp af konditioneret sted præference paradigme

The present protocol describes the Conditioned Place Preference (CPP) as a model of relapse in drug addiction. In this model, animals are first trained to ...

Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer's Disease, Using IntelliCage

Automatiseret, langsigtede adfærdsmæssige Assay for kognitive funktioner i flere genetiske modeller af Alzheimers sygdom, ved hjælp af IntelliCage

Multiple factors&#8212;such as aging and genes&#8212;are frequently associated with cognitive decline. Genetically modified mouse models of cognitive ...

A Conditioned Place Preference Protocol for Measuring Incubation of Craving in Rats

En konditioneret sted præference protokol til måling af inkubation af trang hos rotter

A major cause of repeated relapses is a craving for the drug. Drug craving increases progressively during the abstinence period, a phenomenon termed ...

Paw-Print Analysis of Contrast-Enhanced Recordings (PrAnCER): A Low-Cost, Open-Access Automated Gait Analysis System for Assessing Motor Deficits

Paw-Print Analysis of Contrast-Enhanced Recordings PrAnCER: A Low-Cost, Open-Access Automated Gait Analysis System for Assessing Motor Deficits

Paw-print analyse af kontrast-forbedrede optagelser (PrAnCER): en billig, åben adgang automatiseret Gait analyse system til vurdering af motoriske underskud

Gait analysis is used to quantify changes in motor function in many rodent models of disease. Despite the importance of assessing gait and motor function ...