Name: automated analysis of a nematode population-based chemosensory preference assay
Uploaded: 2017-07-13T14:00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay at JoVE.com

Sommige stammen werden verstrekt door het Caenorhabditis Genetics Center (CGC), dat wordt gefinancierd door NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Dit werk wordt ondersteund door het Howard Hughes Medical Institute, waarmee PWS een onderzoeker is.

<ol>
	<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314, 1-340 (1986).</li><li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans.">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li><li>Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+responds+to+chemical+repellents+by+integrating+sensory+inputs+from+the+head+and+the+tail.">C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail.</a> Curr Biol. 12 (9), 730-734 (2002).</li><li>Hilliard, M. A., Bergamasco, C., Arbucci, S., Plasterk, R. H., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+taste+bitter:+ASH+neurons,+QUI-1,+GPA-3+and+ODR-3+mediate+quinine+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms taste bitter: ASH neurons, QUI-1, GPA-3 and ODR-3 mediate quinine avoidance in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO J. 23 (5), 1101-1111 (2004).</li><li>Zariwala, H. A., Miller, A. C., Faumont, S., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step+response+analysis+of+thermotaxis+in+Caenorhabditis+elegans.">Step response analysis of thermotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 23 (10), 4369-4377 (2003).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (3), 817-821 (1973).</li><li>Wicks, S. R., de Vries, C. J., van Luenen, H. G., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHE-3,+a+cytosolic+dynein+heavy+chain,+is+required+for+sensory+cilia+structure+and+function+in+Caenorhabditis+elegans.">CHE-3, a cytosolic dynein heavy chain, is required for sensory cilia structure and function in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 221 (2), 295-307 (2000).</li><li>Jansen, G., Weinkove, D., Plasterk, R. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+subunit+gpc-1+of+the+nematode+C.+elegans+is+involved+in+taste+adaptation.">The G-protein subunit gpc-1 of the nematode C. elegans is involved in taste adaptation.</a> EMBO J. 21 (5), 986-994 (2002).</li><li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans.">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li><li>Choe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascaroside+signaling+is+widely+conserved+among+nematodes.">Ascaroside signaling is widely conserved among nematodes.</a> Curr Biol. 22 (9), 772-780 (2012).</li><li>Ezcurra, M., Tanizawa, Y., Swoboda, P., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+sensitizes+C.+elegans+avoidance+behaviours+through+acute+dopamine+signalling.">Food sensitizes C. elegans avoidance behaviours through acute dopamine signalling.</a> EMBO J. 30 (6), 1110-1122 (2011).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nat Neurosci. 11 (8), 916-922 (2008).</li><li>Kunitomo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+memory-dependent+synaptic+plasticity+of+a+taste+circuit+regulates+salt+concentration+chemotaxis+in+Caenorhabditis+elegans.">Concentration memory-dependent synaptic plasticity of a taste circuit regulates salt concentration chemotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Commun. 4, 2210 (2013).</li><li>Snow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons.">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).</li><li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+expression+of+TRPV+channel+proteins+defines+their+sensory+functions+and+subcellular+localization+in+C.+elegans+neurons.">Combinatorial expression of TRPV channel proteins defines their sensory functions and subcellular localization in C. elegans neurons.</a> Neuron. 35 (2), 307-318 (2002).</li><li>Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+alternative+behavioral+states+by+serotonin+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans.</a> Neuron. 21 (1), 203-214 (1998).</li><li>Sawin, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans. , (1996).</li><li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parallel+worm+tracker:+A+platform+for+measuring+average+speed+and+drug-induced+paralysis+in+nematodes.">The parallel worm tracker: A platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes.</a> PLoS One. 3 (5), e2208 (2008).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans.">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat Methods. 8 (7), 592-598 (2011).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een kritische stap in het protocol is ervoor te zorgen dat de analyseplaatjes een consistente droogheidsniveau hebben over verschillende experimentele dagen. Verschillende droogniveaus zullen resulteren in verschillende diffusiehoeveelheden van de oplossing in de agar en bijgevolg variaties in gedragsuitkomst. Aldus dienen analyseplaatjes altijd vóór de experimenten vers worden op de middag. Het aantal geteste testen per test moet ook gereguleerd worden om de vergelijkingen tussen behandelingen te vergemakkelijken. Ter referentie legt een wild-type worm 4-10 eieren / u gemiddeld&gt; 360 worms per assay als het bovenstaande wormsynchronisatieprotocol gevolgd is 17 . Als bepaalde mutantstammen slecht ei-leggen, kies dan meer volwassen volwassen wormen voor het ei-leggen om het doelnummer van de nakomelingen te bereiken. Een andere belangrijke stap in het protocol is om worms voorzichtig te behandelen tijdens het wasproces en de wormplaatsing. Worms zijn gevoelig voor mechanische stimuli, die dergelijke stressresponsen opwekken<html> S omkering en ei-liggende remming 18 . Bovendien moet erop worden gezorgd om de ROI nauwkeurig vast te stellen en de optimale drempelconstante waarde voor specifieke lichtomstandigheden te bepalen voordat u verder gaat met de videoanalyse. Het wordt ook aangeraden de kalibratie- en drempelprocessen te herhalen als er een langere periode is verstreken sinds het laatste experiment is uitgevoerd. Een beperking van deze methode is dat het niet geschikt is voor het analyseren van kleine wormbevolkingen. Als echter de juiste controles ter bepaling van de invloed van de aanwezigheid van voedsel op het zintuiglijke gedrag worden uitgevoerd, dan is het ook mogelijk om met deze instelling gebruik te maken van voedsel om de ruimtelijke verkennende locatie van de worm te beperken, zoals in de retentie-analyse. Bovendien is deze methode niet bedoeld voor het bestuderen van stimulusgradiëntnavigatie door de nabijheid en kleine hoeveelheden van de gebruikte controle- en experimentele oplossing druppels. E_content &quot;&gt; In de toekomst kan programmeringssoftware die multi-worm tracking en single-worm feature extractie mogelijk in dit systeem 19 , 20 integreren. Het opnemen van subtiele gedragsparameters van singlewormgedrag zoals omkeringssnelheden en amplitude van lichaamsbochten zullen zorgen voor Een meer gedetailleerde foto van het chemosensorische gedrag van een individuele worm in de context van een populatie gebaseerde test. De test kan ook worden aangepast om de habituatie te bestuderen door de gaten door de ROI te boren met behulp van spuitnaaldjes met de juiste gaugeformaat en het vullen van de gaten met ingeblazen agar Met de experimentele verbinding of controle buffer. Dit zorgt voor een consistente oppervlakconcentratie van de verbinding gedurende een langere periode van opnametijd zoals nodig is tijdens de wabituation studies. Een andere potentiële toepassing van deze methode is het uitvoeren van vergelijkende gedragsstudies over verschillende nematodespesies. Daarnaast is de gedragskamerKan op meerdere manieren worden aangepast om gedragsreacties op multimodale stimuli te bestuderen. Voor optogenetische toepassingen kunnen hoge intensiteit LED-arrays naast de camera-mount worden bevestigd om selectieve neuronen van belang te activeren tijdens de test. Verwarmingselementen, koelsystemen en temperatuursensoren kunnen ook worden toegevoegd aan de installatie om de effecten van temperatuur op sensorisch gedrag te bestuderen. Bovendien kunnen geurafleveringssystemen in de kamer geïnstalleerd worden om interacties tussen geur- en chemosensoriële modaliteiten te onderzoeken.

Voedingsdieren moeten ingangen van meerdere sensorische modaliteiten integreren en passende gedragsstrategieën selecteren om hun omgeving succesvol te kunnen navigeren. Het begrijpen hoe externe sensorische ingangen worden ontvangen en omgezet in neurale informatie om de actieselectie te begeleiden is een centraal doel op het gebied van neurobiologie. De genetische traceerbare nematode, C. elegans , is een aantrekkelijk modelorganisme om de neurale mechanismen van de sensorische biologie en multimodale integratie te bestuderen. Hoewel C. elegans slechts 302 neuronen heeft, kan het detecteren en discrimineren tussen een breed scala aan milieu-stimuli waaronder oplosbare verbindingen, vluchtige geurstoffen en omgevingstemperatuur 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . DeNematode C. elegans vertrouwt zwaar op zijn chemosensorische apparaat om voedselbronnen te lokaliseren en zich te waarschuwen voor mogelijke bedreigingen. Zo hebben gedragstesten die zijn ontworpen om de responsen van wildtype en mutant C. elegans naar chemische stimuli te screenen, een cruciale rol spelen in het dissecteren van de genetische, cellulaire en neurale mechanismen die onderliggend zijn aan C. elegans &#39;s opvallende sensorische mogelijkheden. Om het antwoord op oplosbare verbindingen te analyseren zijn drie typen analyses beschreven - de druppeltest, de chemotaxis-analyse en de retentie-analyse. In de valtest wordt een kleine druppel van de verbinding geplaatst op de staart van een bewegende worm en de beslissing van de worm om achteruit of vooruit wanneer de vloeistof bereikt het voorste sensorische inrichting gescoord 4. De druppeltest vereist weinig experimentele voorbereiding en is handig als de monstergrootte van wormen klein is, zoals bij laserworms. Echter, als slechts één wormKan tegelijkertijd worden geanalyseerd en de experimentator moet gedurende de gehele duur van de test aanwezig zijn, de druppeltest kan tijdrovend zijn. De druppeltest is ook kwetsbaar voor variaties in druppelafgifte tussen elke worm in een monster, die de algemene resultaten van de test kan beïnvloeden. Een andere beperking van de dalingstest is dat het alleen kan worden gebruikt om de reactie van de worm op aversieve verbindingen te analyseren, aangezien het niet mogelijk is om een ​​aantrekkelijk of neutraal effect van de verbinding te onderscheiden van de voorwaartse beweging van de worm. De chemotaxisassay voor oplosbare verbindingen omvat in het algemeen een agarplaat in vier kwadranten, waarbij de experimentele oplossing in de agar van twee tegenover elkaar gelegen kwadranten gemengd wordt en de controleoplossing gemengd in de andere twee kwadranten 8 , 9 . Bij het begin van de test wordt een druppel bufferwormen geplaatst in het midden van de plaat en het aantal wormen in<html> Elk kwadrant wordt op verschillende tijdstippen gescoord. De chemotaxis-analyse levert een grotere statistische kracht in vergelijking met de dalingstest, aangezien grote hoeveelheden wormen in elke test worden getest. Eén beperking van deze methode is echter dat de bereiding van de chemotaxis assay platen grote hoeveelheden van de experimentele verbinding vereist. Dit maakt het moeilijk om grootschalige gedragsschermen te voeren als een ingewikkeld zuiveringsproces met beperkte opbrengsten nodig is om de verbinding van belang te verkrijgen, zoals bij de ascaroside-signaleringsmoleculen 10 . Daarnaast is de manuele tellen van wormen in de test gevoelig voor fouten en de storing van de platen tijdens het tellen kan de resultaten beïnvloeden. In tegenstelling tot de twee bovengenoemde methoden gebruikt de retentie-analyse machinevisie, die de fout tijdens het scoreproces minimaliseert en de interferentie van de experimentator vermindert tijdens de analyse<html> &gt; 11. Geautomatiseerde analyse van video-opnames van wormgedrag kan ook mogelijk subtiele gedragsdynamiek onthullen die gemist wordt wanneer het scoren alleen op een paar discrete tijdspunten wordt uitgevoerd. In de retentietest worden twee oplossingsvlekken aan de tegenover elkaar gelegen kanten van een kleine cirkelvormige bacteriële voedingspatch toegevoegd, gevolgd door de plaatsing van een klein aantal wormen in het midden van de voedingspatch. Het gedrag van de wormen wordt dan opgenomen, geanalyseerd en een voorkeursindexwaarde wordt berekend op basis van het totale aantal wormpixels in elk oplossingsgebied. Hoewel de aanwezigheid van een aantrekkelijke voedingspatch minder maal populaties van wormen in elke test kan gebruiken, is eerder aangetoond dat het voedsel vermijdingsgedrag is opgelost aan oplosbare afstotende stoffen 12 . Bovendien tonen worms een fotofobische reactie op kortlichtlicht en het gebruik van microscooplichtbronnen die wit licht uitstoten in het gedragsopnameprogramma kan gedrag beïnvloedenS = &quot;xref&quot;&gt; 13. Het doel van de methode die in dit artikel wordt besproken is het opnemen en analyseren van C. elegans &#39; voorkeur voor oplosbare verbindingen door gebruik te maken van een populatie gebaseerde assay. Hiertoe integreert en verbetert de huidige werkwijze aspecten uit alle drie de eerder besproken methodes. Het maakt het mogelijk om grote populaties worms te testen en vereist slechts kleine hoeveelheden van de experimentele oplossing die bij elke test moet worden gebruikt. Daarnaast wordt de test uitgevoerd in een op maat gemaakte ingesloten gedragskamer met infrarood LED-achtergrondverlichting om de effecten van het korte golflicht op gedrag te minimaliseren. Elke kamer kan ook uitgerust worden met meerdere microscoopcamera&#39;s, waardoor de experimentele doorvoer wordt vergroot zonder de bankruimte in gevaar te brengen. Ten slotte geeft videoanalysesoftware de voorkeurindexwaarde voor elke video en een bijbehorende wormbezettingsgrafiek om de gedragsgedrag van de populatie over de tijd te visualiseren. De kameropstelling en aSsay protocol kan verder worden aangepast om multimodale gedragsreacties te bestuderen, zoals het effect van geurstoffen of temperatuur op chemosensorische gedragingen. In dit artikel wordt de constructie van de gedragskamer en het testprotocol beschreven. Het toont ook het nut van deze methode aan bij het analyseren van de respons van wild-type wormen en chemosensorische defecte mutanten aan de bekende oplosbare afstotende, koperionen 4 . Ten slotte wordt het videoanalyseproces met behulp van de meegeleverde software gedetailleerd beschreven.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Aluminum T-slotted framing extrusions</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">47065T101</td>
			<td style="width:359px;">Single profile, 1&#34; size, solid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brackets</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T236</td>
			<td>1&#34; long for 1&#34; high single profile extrusions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Compact end-feed fasteners</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T139</td>
			<td>1&#34; (single), pack of 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Twist-in solid panel holders</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T251</td>
			<td>For 1&#34; high extrusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic end caps</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T91</td>
			<td>For 1&#34; high extrusion</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Optically clear cast acrylic sheet</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">8560K211</td>
			<td>3/16&#34; thick, 12&#34; x 12&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinyl-coated polyester fabric</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">88505K57</td>
			<td>0.027&#34; thick, 61&#34; width, black</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brass grommets</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>9604K22</td>
			<td>Trade size 0, 0.545&#34; outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Steel washers</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>90107A029</td>
			<td>1/4&#34; screw size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rounded head screws</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>90272A546</td>
			<td>1/4&#34;-20 thread size, 1-1/2&#34; long</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Standard operating backlight</td>
			<td style="width:147px;">Smart Vision Lights</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td>8&#34;x8&#34;, infrared 850nm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">IVP-C1 Variable Control Pot</td>
			<td style="width:147px;">Smart Vision Lights</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">T1 Power Supply</td>
			<td style="width:147px;">Smart Vision Lights</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Dino lite Pro AM4113T</td>
			<td style="width:147px;">Dino-Lite Digital Microscope</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">MS09B microscope stand</td>
			<td style="width:147px;">Dino-Lite Digital Microscope</td>
			<td>See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated analysis of a nematode population-based chemosensory preference assay

De nematode, het compacte zenuwstelsel van Caenorhabditis elegans van slechts 302 neuronen, ligt onder een divers repertoire van gedrag. Om de dissectie van de neurale circuits die onder deze gedragingen liggen te vergemakkelijken, is het nodig om robuuste en reproduceerbare gedragsanalyses te ontwikkelen. Vorige C. elegans gedragsstudies hebben gebruik gemaakt van variaties van een &quot;drop test&quot;, een &quot;chemotaxis assay&quot; en een &quot;retentie assay&quot; om het antwoord van C. elegans op oplosbare verbindingen te onderzoeken. De werkwijze beschreven in dit artikel beoogt de complementaire sterktes van de drie eerder genoemde assays te combineren. Kortom, een kleine cirkel in het midden van elke meetplaat is verdeeld in vier kwadranten met de controle en experimentele oplossingen afwisselend geplaatst. Na de toevoeging van de wormen worden de analyseplaatjes geladen in een gedragskamer waar microscopecamera&#39;s de ontmoetingen van de wormen opnemen bij de behandelde gebieden. Automatische video analyse wordt dan uitgevoerd aEn een waarde voor voorkeurindex (PI) voor elke video wordt gegenereerd. De videoverzameling en geautomatiseerde analysefuncties van deze methode minimaliseren de betrokkenheid van de experimentator en eventuele bijbehorende fouten. Bovendien worden kleine hoeveelheden van de experimentele verbinding per test gebruikt en de multicamera-setup van de gedragskamer verhoogt de experimentele doorvoer. Deze methode is bijzonder nuttig voor het uitvoeren van gedragsschermen van genetische mutanten en nieuwe chemische verbindingen. Deze methode is echter niet geschikt voor het bestuderen van stimulusgradiëntnavigatie door de nabijheid van de controle- en experimentele oplossingsgebieden. Het mag ook niet worden gebruikt als er slechts een kleine populatie wormen beschikbaar is. Hoewel geschikt voor het analyseren van reacties alleen op oplosbare verbindingen in zijn huidige vorm, kan deze methode gemakkelijk worden aangepast om multimodale sensorische interactie en optogenetische studies op te nemen. Deze methode kan ook worden aangepast om de chemosensorische reacties van andere nematodespecies te analyseren. </p&gt;

Figuur 3A toont de voorkeursindexwaarden die zijn verkregen voor verschillende genotype- en behandelingsparingen. Een voorkeursindexwaarde van 1 duidt op een sterke aantrekkingskracht op de oplossing die in de experimentele ROI wordt geplaatst terwijl een voorkeursindexwaarde van -1 een sterke afstoting aangeeft. Een voorkeursindex van 0,02 werd verkregen wanneer de M13 bufferoplossing in zowel de controle- als de experimentele ROI&#39;s werd geplaatst, waaruit blijkt dat er geen ruimtelijke voorspanning ten opzichte van ROI is. N2 worms vermeden de koperionen sterk vermeden, wat resulteerde in een voorkeurindex van -0,67, wat de vorige bevindingen bevestigt dat koperionen sterk afstotend zijn ( Supplementary Movie 1 ) 4 . Osm-3 mutanten, die een goede vorming van de distale segmenten van sensorische cilia ontbrak, vertoonde een significant verminderd vermijden van koperionen (PI = -0,19) 15 . Ocr-2 mutanten, welke zijn de<html> Fectief in veel ASH-gemedieerde nociceptieve reacties, waaronder kopervermijding, vertoont ook aanzienlijk verminderde vermijding en zelfs een zachte aantrekkingskracht op koperionen (PI = 0,19) ( Aanvullende Film 2 ) 16 . Figuur 3B toont representatieve wormbezettingsgraden, die de dichtheid van wormen in de controle versus de experimentele ROI&#39;s in de tijd in elke video aanduiden. Hoe donkerder de kleur van het plotgebied, hoe groter het aantal wormpixels in de ROI. De bezettingsgrafiek voor N2-wormen die behandeld zijn met de M13-bufferregeling, laat zien dat het aantal wormen in beide ROI&#39;s gelijk blijft tijdens de test. Echter, de bezettingsgrafiek voor N2-wormen die met koperionen behandeld zijn, duiden erop dat de wormen de experimentele ROI sterk en consistent doorlopen tijdens de test. Gimg &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55963 / 55963fig1.jpg &quot;/&gt; Figuur 1: Foto en schematische representatie van gedragskamerontwerp. ( A ) Vooraanzicht van de gedragskamerinstelling (links) en bijbehorende schematische weergave van kamerkader (rechts). Opaque polyester lakens omsluiten de kamer op alle gezichten, behalve de onderkant, waardoor licht door het infrarood backlight paneel mogelijk maakt. De cijfers 1, 2 en 3 komen overeen met de extrusie lagen in (B). ( B ) Schematisch van bovenaanzicht van extrusielagen die het gedragskamerframe omvatten. Dit omvat de bovenste laag (1), de montagelaag (2) van de middencamera mount en de onderste laaglaag (3). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig2.jpg"/&gt; Figuur 2: Oplossings-plaatsing en Plate-alignment Templates. ( A ) De oplossing-plaatsingsjabloon heeft vier kwadranten en nummeruitlijningstekeners. De besturingsoplossing wordt in de linkerboven- en rechterkwadranten geplaatst, terwijl de experimentele oplossing in de linkerbovenhoek en rechtsboven wordt geplaatst. ( B ) De plaatuitlijningsjabloon heeft alleen nummeruitlijningstekeners om de worms in het zichtveld te beperken tijdens video-opname en analyse. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig3.jpg" /> Figuur 3: Voorbeeldgegevens verzameld met behulp van deze analyse. ( A ) Preference Index (PI) waarden voor wildtype N2 en mutant C. elegans </e<html> m&gt; in reactie op M13 buffer en 10 mM CuCl2. N2 worms lieten geen voorkeur zien tussen controle en experimentele ROI&#39;s wanneer de M13 controle oplossing in beide ROI&#39;s werd geplaatst, maar de experimentele ROI sterk vermeden toen koper ionen daarin werden geplaatst (respectievelijk PI = 0,02 en -0,67). Osm-3 (p802) mutanten en ocr-2 (ak47) mutanten toonden significant verminderd vermijden van koperionen ten opzichte van N2 (PI = -0,1 en 0,2 respectievelijk). N = 6 analyses voor elke genotypebehandeling pairing,&gt; 360 worms per assay, error bars geven ± 1 SEM, *** p &lt;0.001, eenrichtings ANOVA gevolgd door post-hoc Tukey Honestly Significant Difference (HSD) test. ( B ) Representatieve wormbezettingsplaatsen voor N2-wormen met M13-buffer in zowel ROIs (bovenste) als N2-wormen met M13-buffer in de controle ROI en koperionen in de experimentele ROI (bodem). De kleurenschaal onder elke bezettingsgrafiek vertegenwoordigt het aantal wormpixels.Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien. Aanvullende film 1: Gedragsreactie van N2-wormen tot 10 mM koperchloride. Worms worden aangetrokken tot de controle kwadranten met M13 buffer (linksboven en rechtsonder), maar vermijd de quadranten die koper ionen bevatten opgelost in M13 buffer (rechtsboven en linksonder). De video werd opgenomen op 1 frame per seconde en speelde 15x op. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_Video_1.mp4">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a> Aanvullende film 2: Gedragsreactie van ocr-2 (ak47) wormen tot 10 mM koperchlooride. Worms lopen in ongeveer de gelijke mate rond in zowel de controlequadranten met M13 buffer (linksboven en rechtsonder) en het kwadrantS die koper ionen bevatten, opgelost in M13 buffer (rechtsboven en linksonder) gedurende de opnameduur. De mutanten tonen een lichte voorkeur voor de kwadranten die koperionen bevatten bij het begin van de opname. De video werd opgenomen op 1 frame per seconde en speelde 15x op. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_video_2.mp4">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a> Aanvullend bestand: Solution-placement en Plate-alignment Templates. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/JoVE_template.pptx">Klik hier om dit bestand te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay at JoVE.com

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

We presenteren een gedragsopname-opstelling en protocol waarmee geautomatiseerde analyse van de nematode, Caenorhabditis elegans , de voorkeur geeft aan oplosbare verbindingen in een populatie gebaseerde assay. Dit artikel beschrijft de constructie van een gedragskamer, het gedragsprotocol en het gebruik van videoanalyse software.

Geautomatiseerde Analyse van een Chemische Sensorische Preference Assay van een Nematodebevolking

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

Research

JoVE Journal

Behavior

Measurement of Fronto-limbic Activity Using an Emotional Oddball Task in Children with Familial High Risk for Schizophrenia

Meting van Fronto-limbische activiteit met een emotionele Excentrieke Task bij kinderen met Familial hoog risico op schizofrenie

Adolescence is a critical developmental period where the early symptoms of schizophrenia frequently emerge. First-degree relatives of people with ...

Fat Preference: A Novel Model of Eating Behavior in Rats

Vet voorkeur: A Novel Model van eetgedrag bij ratten

Obesity is a growing problem in the United States of America, with more than a third of the population classified as obese. One factor contributing to ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Experimentele Evaluatie van de muis Gezelligheid behulp van een geautomatiseerd Beeldverwerking Approach

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Assessment of Cocaine-induced Behavioral Sensitization and Conditioned Place Preference in Mice

Evaluatie van cocaïne geïnduceerde sensitisatie en geconditioneerd Place Preference in Muizen

It is thought that rewarding experiences with drugs create strong contextual associations and encourage repeated intake. In turn, repeated exposures to ...

Protocol for Data Collection and Analysis Applied to Automated Facial Expression Analysis Technology and Temporal Analysis for Sensory Evaluation

Protocol voor gegevensverzameling en analyse Toegepast op Automated Gezichtsuitdrukking Analysis Technology and Temporal Analysis voor de sensorische evaluatie

We demonstrate a method for capturing emotional response to beverages and liquefied foods in a sensory evaluation laboratory using automated facial ...

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

An Automated Rapid Iterative Negative Geotaxis Assay for Analyzing Adult Climbing Behavior in a Drosophila Model of Neurodegeneration

Een geautomatiseerde snelle iteratieve negatieve Geotaxis Assay voor het analyseren van volwassen klimmen gedrag in een Drosophila Model van neurodegeneratie

Neurodegenerative diseases are frequently associated with a progressive loss of movement ability, reduced life span, and age-dependent neurodegeneration. ...

Reinstatement of Drug-seeking in Mice Using the Conditioned Place Preference Paradigm

Herstel van de Drug-zoekende in muizen met behulp van de geconditioneerde plaats voorkeur paradigma

The present protocol describes the Conditioned Place Preference (CPP) as a model of relapse in drug addiction. In this model, animals are first trained to ...

Automated, Long-term Behavioral Assay for Cognitive Functions in Multiple Genetic Models of Alzheimer's Disease, Using IntelliCage

Geautomatiseerd, op lange termijn gedrags Assay voor cognitieve functiestoornissen bij meerdere genetische modellen de ziekte van Alzheimer, met behulp van IntelliCage

Multiple factors&#8212;such as aging and genes&#8212;are frequently associated with cognitive decline. Genetically modified mouse models of cognitive ...

A Conditioned Place Preference Protocol for Measuring Incubation of Craving in Rats

Een geconditioneerde plaats voorkeur Protocol voor het meten van de incubatie van verlangen bij ratten

A major cause of repeated relapses is a craving for the drug. Drug craving increases progressively during the abstinence period, a phenomenon termed ...

Paw-Print Analysis of Contrast-Enhanced Recordings (PrAnCER): A Low-Cost, Open-Access Automated Gait Analysis System for Assessing Motor Deficits

Paw-Print Analysis of Contrast-Enhanced Recordings PrAnCER: A Low-Cost, Open-Access Automated Gait Analysis System for Assessing Motor Deficits

Paw-Print analyse van contrast-Enhanced opnames (PrAnCER): een voordelig, Open-Access automatisch analysesysteem voor de beoordeling van motorische tekorten

Gait analysis is used to quantify changes in motor function in many rodent models of disease. Despite the importance of assessing gait and motor function ...