Name: automated analysis of a nematode population-based chemosensory preference assay
Uploaded: 2017-07-13T14:00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay at JoVE.com

Einige Stämme wurden von der Caenorhabditis Genetics Center (CGC), die von NIH Office of Research Infrastructure Programme (P40 OD010440) finanziert wird, zur Verfügung gestellt. Diese Arbeit wird vom Howard Hughes Medical Institute unterstützt, mit dem PWS ein Ermittler ist.

<ol>
	<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314, 1-340 (1986).</li><li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans.">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li><li>Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+responds+to+chemical+repellents+by+integrating+sensory+inputs+from+the+head+and+the+tail.">C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail.</a> Curr Biol. 12 (9), 730-734 (2002).</li><li>Hilliard, M. A., Bergamasco, C., Arbucci, S., Plasterk, R. H., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+taste+bitter:+ASH+neurons,+QUI-1,+GPA-3+and+ODR-3+mediate+quinine+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms taste bitter: ASH neurons, QUI-1, GPA-3 and ODR-3 mediate quinine avoidance in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO J. 23 (5), 1101-1111 (2004).</li><li>Zariwala, H. A., Miller, A. C., Faumont, S., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step+response+analysis+of+thermotaxis+in+Caenorhabditis+elegans.">Step response analysis of thermotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 23 (10), 4369-4377 (2003).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (3), 817-821 (1973).</li><li>Wicks, S. R., de Vries, C. J., van Luenen, H. G., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHE-3,+a+cytosolic+dynein+heavy+chain,+is+required+for+sensory+cilia+structure+and+function+in+Caenorhabditis+elegans.">CHE-3, a cytosolic dynein heavy chain, is required for sensory cilia structure and function in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 221 (2), 295-307 (2000).</li><li>Jansen, G., Weinkove, D., Plasterk, R. H. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+sensitizes+C.+elegans+avoidance+behaviours+through+acute+dopamine+signalling.">Food sensitizes C. elegans avoidance behaviours through acute dopamine signalling.</a> EMBO J. 30 (6), 1110-1122 (2011).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nat Neurosci. 11 (8), 916-922 (2008).</li><li>Kunitomo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+memory-dependent+synaptic+plasticity+of+a+taste+circuit+regulates+salt+concentration+chemotaxis+in+Caenorhabditis+elegans.">Concentration memory-dependent synaptic plasticity of a taste circuit regulates salt concentration chemotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Commun. 4, 2210 (2013).</li><li>Snow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons.">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).</li><li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+expression+of+TRPV+channel+proteins+defines+their+sensory+functions+and+subcellular+localization+in+C.+elegans+neurons.">Combinatorial expression of TRPV channel proteins defines their sensory functions and subcellular localization in C. elegans neurons.</a> Neuron. 35 (2), 307-318 (2002).</li><li>Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+alternative+behavioral+states+by+serotonin+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans.</a> Neuron. 21 (1), 203-214 (1998).</li><li>Sawin, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans. , (1996).</li><li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parallel+worm+tracker:+A+platform+for+measuring+average+speed+and+drug-induced+paralysis+in+nematodes.">The parallel worm tracker: A platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes.</a> PLoS One. 3 (5), e2208 (2008).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans.">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat Methods. 8 (7), 592-598 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Ein kritischer Schritt in dem Protokoll ist sicherzustellen, dass die Testplatten eine konsistente Trockenheit über verschiedene experimentelle Tage haben. Unterschiedliche Trockenheitsniveaus führen zu unterschiedlichen Diffusionsraten der Lösung in den Agar und damit zu Variationen des Verhaltens. So sollten die Testplatten immer am Nachmittag vor den Experimenten frisch gemacht werden. Die Anzahl der getesteten Würmer pro Assay sollte auch für einen leichten Vergleich zwischen Behandlungen geregelt werden. Als Referenz, ein Wildtyp-Wurm legt 4-10 Eier / h im Durchschnitt ergibt&gt; 360 Würmer pro Assay, wenn das Wurm-Synchronisationsprotokoll oben folgt 17 . Wenn bestimmte Mutanten-Stämme Ei-Verlegung defekt sind, wählen Sie mehr gravid Erwachsene Würmer für Ei-Verlegung, um die Ziel-Zahl der Nachkommen zu erreichen. Ein weiterer wichtiger Schritt im Protokoll ist es, die Würmer sanft während des Waschprozesses und der Wurmplatzierung zu behandeln. Würmer sind empfindlich gegenüber mechanischen Reizen, die Stressreaktionen wie<html> S Umkehrungen und Eiablage Inhibition 18 . Weiterhin sollte darauf geachtet werden, den ROI genau zu definieren und den optimalen Schwellenwertkonstantenwert für bestimmte Lichtverhältnisse zu bestimmen, bevor die Videoanalyse durchgeführt wird. Es wird auch empfohlen, dass die Kalibrier- und Schwellwertprozesse wiederholt werden, wenn eine lange Zeitspanne seit dem letzten Versuch verstrichen ist. Eine Beschränkung dieser Methode ist, dass es nicht geeignet ist, kleine Wurmpopulationen zu untersuchen. Wenn jedoch die geeigneten Kontrollen zur Bestimmung des Einflusses des Vorhandenseins von Nahrungsmitteln auf das sensorische Verhalten durchgeführt werden, dann ist die Verwendung von Nahrungsmitteln, um die räumliche Erkundungsstelle der Würmer zu beschränken, wie bei dem Retentionsassay, auch bei dieser Einrichtung möglich. Darüber hinaus ist diese Methode nicht für das Studium der Stimulus-Gradienten-Navigation aufgrund der engen Nähe und geringe Mengen der Kontrolle und experimentelle Lösung Tropfen verwendet. E_content &quot;&gt; In der Zukunft kann die Programmiersoftware, die eine Mehrfach-Wurmverfolgung und eine Single-Wurm-Merkmalsextraktion ermöglicht, in dieses System integriert werden. 19 , 20. Die Aufzeichnung von subtilen Verhaltensparametern des einzelnen Wurmverhaltens wie Umkehrgeschwindigkeiten und Amplituden von Körperbiegungen wird gegeben Ein detaillierteres Bild des chemosensorischen Verhaltens eines einzelnen Wurms im Kontext eines Populations-basierten Assays. Der Assay kann auch modifiziert werden, um die Gewöhnung zu untersuchen, indem er Löcher durch den ROI mit Spritzen-Nadeln mit der entsprechenden Maßgrße bohrt und die Löcher mit Agar infundiert füllt Mit der experimentellen Verbindung oder Kontrollpuffer, was eine gleichmäßigere Oberflächenkonzentration der Verbindung über einen längeren Zeitraum der Aufzeichnungszeit sicherstellt, wie es bei Gewöhnungstests erforderlich ist. Eine weitere mögliche Anwendung dieser Methode besteht darin, vergleichende Verhaltensstudien über verschiedene Nematodenarten durchzuführen. Darüber hinaus ist die VerhaltenskammerKann auf vielfältige Weise modifiziert werden, um Verhaltensreaktionen auf multimodale Reize zu untersuchen. Für optogenetische Anwendungen können neben der Kamerahalterung hochintensive LED-Arrays angebracht werden, um während des Assays selektiv Neurone zu aktivieren. Heizelemente, Kühlsysteme und Temperatursensoren können auch dem Setup hinzugefügt werden, um die Auswirkungen der Temperatur auf sensorische Verhaltensweisen zu untersuchen. Darüber hinaus können Geruchsabgabesysteme innerhalb der Kammer installiert werden, um Wechselwirkungen zwischen geruchs- und chemosensorischen Modalitäten zu untersuchen.

Das Füttern von Tieren muss Eingaben aus mehreren sensorischen Modalitäten integrieren und geeignete Verhaltensstrategien auswählen, um ihre Umgebung erfolgreich zu navigieren. Verständnis, wie externe sensorische Eingaben empfangen und in neuronale Informationen umgesetzt werden, um die Aktionsauswahl zu leiten, ist ein zentrales Ziel im Bereich der Neurobiologie. Der genetisch tragbare Nematoden, C. elegans , ist ein attraktiver Modellorganismus, in dem die neuronalen Mechanismen der sensorischen Biologie und der multimodalen Integration untersucht werden können. Obwohl C. elegans nur 302 Neuronen hat, kann er zwischen einer Vielzahl von Umweltreizen einschließlich löslicher Verbindungen, flüchtiger Geruchsstoffe und Umgebungstemperatur 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 erkennen und unterscheiden . DasNematode C. elegans stützt sich stark auf seinen chemosensorischen Apparat, um Nahrungsmittelquellen zu lokalisieren und sich auf potenzielle Bedrohungen aufmerksam zu machen. So spielen Verhaltensassays, die entworfen sind, um die Reaktionen von Wildtyp- und Mutanten C. elegans auf chemische Reize zu untersuchen, eine entscheidende Rolle bei der Sezierung der genetischen, zellulären und neuronalen Mechanismen, die den bemerkenswerten sensorischen Fähigkeiten von C. elegans zugrunde liegen. Um die Reaktion auf lösliche Verbindungen zu untersuchen, wurden drei Arten von Assays beschrieben - der Falltest, der Chemotaxisassay und der Retentionsassay. In dem Falltest wird ein kleiner Tropfen der Verbindung am Schwanz eines beweglichen Schneckers platziert und die Entscheidung des Wurms, sich umzukehren oder vorwärts zu bewegen, sobald die Flüssigkeit den vorderen sensorischen Apparat erreicht hat, wird erzielt 4 . Der Drop-Test erfordert wenig experimentelle Vorbereitung und ist nützlich, wenn die Stichprobengröße der Würmer klein ist, wie bei lasergestützten Würmern. Doch als nur ein wurmKann zu einem Zeitpunkt getestet werden und der Experimentator muss während der gesamten Dauer des Assays vorhanden sein, der Drop-Test kann zeitaufwendig sein. Der Falltest ist auch anfällig für Variationen in der Tropfenabgabe zwischen jedem Wurm innerhalb einer Probe, die die Gesamtergebnisse des Assays beeinflussen können. Eine weitere Einschränkung des Falltests ist, dass es nur verwendet werden kann, um die Reaktion des Wurms auf aversive Verbindungen zu untersuchen, da es nicht möglich ist, zwischen einer attraktiven oder neutralen Wirkung der Verbindung aus der Vorwärtsbewegung des Wurms zu unterscheiden. Der Chemotaxis-Assay für lösliche Verbindungen beinhaltet im allgemeinen das Aufteilen einer Agarplatte in vier Quadranten, wobei die experimentelle Lösung in den Agar von zwei gegenüberliegenden Quadranten gemischt und die Kontrolllösung in die beiden anderen Quadranten 8 , 9 gemischt wird. Zu Beginn des Assays wird ein Tropfen Puffer, der Würmer enthält, in der Mitte der Platte platziert und die Anzahl der Würmer in<html> Jeder Quadrant wird zu verschiedenen Zeitpunkten bewertet. Der Chemotaxis-Assay bietet eine größere statistische Leistung im Vergleich zum Falltest, da eine große Anzahl von Würmern in jedem Assay getestet wird. Eine Einschränkung dieses Verfahrens besteht jedoch darin, daß die Herstellung der Chemotaxis-Testplatten große Mengen der experimentellen Verbindung erfordert. Dies wird es schwierig machen, großräumige Verhaltensbildschirme durchzuführen, wenn ein komplizierter Reinigungsprozess mit begrenzten Ausbeuten erforderlich ist, um die interessierende Verbindung zu erhalten, wie im Fall der Ascarosid-Signalmoleküle 10 . Darüber hinaus ist das manuelle Zählen von Würmern während des gesamten Assays fehleranfällig und die Störung der Platten während des Zählvorgangs könnte die Ergebnisse beeinflussen. Im Gegensatz zu den beiden vorgenannten Verfahren verwendet der Retentionsassay eine Machine Vision, die den Fehler während des Scoring-Prozesses minimiert und die Interferenz des Experimentators während des Assays reduziert<html> &gt; 11 Die computergesteuerte Analyse von Videoaufnahmen des Wurmverhaltens kann auch potenziell subtilere Verhaltensdynamiken aufdecken, die beim Scoring nur bei wenigen diskreten Zeitpunkten verpasst werden. In dem Retentionstest werden zwei Lösungspunkte auf gegenüberliegenden Seiten eines kleinen kreisförmigen bakteriellen Nahrungsmittelflecks hinzugefügt, gefolgt von der Platzierung einer kleinen Anzahl von Würmern in der Mitte des Nahrungsmittelflecks. Das Verhalten der Würmer wird dann aufgezeichnet, analysiert und ein Präferenzindexwert wird basierend auf der Gesamtzahl der Wurmpixel in jedem Lösungsbereich berechnet. Obwohl die Anwesenheit eines attraktiven Nahrungsmittelflecks ermöglicht, dass kleinere Populationen von Würmern in jedem Assay verwendet werden, wurde bisher gezeigt, dass das Vermeidungsverhalten für lösliche Repellanten 12 sensibilisiert wurde. Darüber hinaus zeigen Würmer eine photophobe Antwort auf kurzwelliges Licht und die Verwendung von Mikroskop-Lichtquellen, die weißes Licht in der Verhaltensaufzeichnung einrichten, können das Verhalten beeinflussenS = &quot;xref&quot;&gt; 13 Der Zweck der in diesem Artikel diskutierten Methode ist die Aufzeichnung und Analyse von C. elegans &#39; Präferenz für lösliche Verbindungen unter Verwendung eines Populations-basierten Assays. Zu diesem Zweck integriert und verbessert das aktuelle Verfahren Aspekte aus allen drei der zuvor diskutierten Methoden. Es ermöglicht große Populationen von Würmern getestet werden und erfordert nur geringe Mengen der experimentellen Lösung in jedem Assay verwendet werden. Darüber hinaus wird der Assay innerhalb einer kundenspezifischen umschlossenen Verhaltenskammer mit Infrarot-LED-Hintergrundbeleuchtung durchgeführt, um die Auswirkungen von kurzwelligem Licht auf das Verhalten zu minimieren. Jede Kammer kann auch mit mehreren Mikroskopkameras ausgerüstet werden, was den experimentellen Durchsatz erhöht, ohne den Bankraum zu beeinträchtigen. Schließlich gibt die Videoanalyse-Software den Präferenzindexwert für jedes Video sowie einen begleitenden Wurmbelegungsplan aus, um die Dynamik der Populationsverhalten im Laufe der Zeit zu visualisieren. Der Kammeraufbau und aSsay-Protokoll kann weiter modifiziert werden, um multimodale Verhaltensreaktionen wie die Wirkung von Geruchsstoffen oder Temperaturen auf chemosensorische Verhaltensweisen zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt die Konstruktion der Verhaltenskammer und des Testprotokolls. Es zeigt auch die Nützlichkeit dieses Verfahrens bei der Untersuchung der Reaktion von Wildtyp-Würmern und chemosensorischen defekten Mutanten auf die bekannten löslichen Repellanten, Kupferionen 4 . Schließlich ist der Videoanalyseprozess mit der mitgelieferten Software detailliert.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Aluminum T-slotted framing extrusions</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">47065T101</td>
			<td style="width:359px;">Single profile, 1&#34; size, solid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brackets</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T236</td>
			<td>1&#34; long for 1&#34; high single profile extrusions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Compact end-feed fasteners</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T139</td>
			<td>1&#34; (single), pack of 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Twist-in solid panel holders</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T251</td>
			<td>For 1&#34; high extrusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic end caps</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T91</td>
			<td>For 1&#34; high extrusion</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Optically clear cast acrylic sheet</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">8560K211</td>
			<td>3/16&#34; thick, 12&#34; x 12&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinyl-coated polyester fabric</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">88505K57</td>
			<td>0.027&#34; thick, 61&#34; width, black</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brass grommets</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>9604K22</td>
			<td>Trade size 0, 0.545&#34; outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Steel washers</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>90107A029</td>
			<td>1/4&#34; screw size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rounded head screws</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>90272A546</td>
			<td>1/4&#34;-20 thread size, 1-1/2&#34; long</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Standard operating backlight</td>
			<td style="width:147px;">Smart Vision Lights</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td>8&#34;x8&#34;, infrared 850nm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">IVP-C1 Variable Control Pot</td>
			<td style="width:147px;">Smart Vision Lights</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">T1 Power Supply</td>
			<td style="width:147px;">Smart Vision Lights</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Dino lite Pro AM4113T</td>
			<td style="width:147px;">Dino-Lite Digital Microscope</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">MS09B microscope stand</td>
			<td style="width:147px;">Dino-Lite Digital Microscope</td>
			<td>See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated analysis of a nematode population-based chemosensory preference assay

Die Nematode, Caenorhabditis elegans &#39;kompaktes Nervensystem von nur 302 Neuronen unterliegt einem vielfältigen Repertoire von Verhaltensweisen. Um die Sezierung der neuronalen Schaltkreise zu erleichtern, die diesen Verhaltensweisen zugrunde liegen, ist die Entwicklung von robusten und reproduzierbaren Verhaltensassays notwendig. Vorherige C. elegans Verhaltensstudien haben Variationen eines &quot;Falltests&quot;, eines &quot;Chemotaxisassays&quot; und eines &quot;Retentionstests&quot; verwendet, um die Reaktion von C. elegans auf lösliche Verbindungen zu untersuchen. Die in diesem Artikel beschriebene Methode versucht, die komplementären Stärken der drei vorgenannten Assays zu kombinieren. Kurz gesagt, ein kleiner Kreis in der Mitte jeder Testplatte wird in vier Quadranten unterteilt, wobei die Kontroll- und experimentellen Lösungen abwechselnd platziert sind. Nach dem Hinzufügen der Würmer werden die Testplatten in eine Verhaltenskammer geladen, in der Mikroskopkameras die Wurmbegegnungen mit den behandelten Bereichen aufzeichnen. Automatisierte Videoanalyse wird dann durchgeführtEs wird ein Präferenzindex (PI) -Wert für jedes Video erzeugt. Die Videoerfassung und die automatisierten Analysemerkmale dieser Methode minimieren die Beteiligung des Experimentators und die damit verbundenen Fehler. Weiterhin werden pro Assay winzige Mengen der experimentellen Verbindung verwendet und die Multikamera-Einstellung der Verhaltenskammer erhöht den experimentellen Durchsatz. Diese Methode eignet sich besonders für die Durchführung von Verhaltensbildschirmen von genetischen Mutanten und neuartigen chemischen Verbindungen. Diese Methode eignet sich jedoch nicht für das Studium der Stimulus-Gradienten-Navigation aufgrund der engen Nähe der Kontroll- und Versuchslösungsregionen. Es sollte auch nicht verwendet werden, wenn nur eine kleine Population von Würmern zur Verfügung steht. Obwohl es geeignet ist, Reaktionen nur auf lösliche Verbindungen in ihrer gegenwärtigen Form zu untersuchen, kann dieses Verfahren leicht modifiziert werden, um multimodale sensorische Wechselwirkung und optogenetische Studien anzupassen. Dieses Verfahren kann auch angepasst werden, um die chemosensorischen Reaktionen anderer Nematodenarten zu untersuchen. </P&gt;

Fig. 3A zeigt die Präferenzindexwerte, die für verschiedene Genotyp- und Behandlungspaarungen erhalten wurden. Ein Präferenzindexwert von 1 zeigt eine starke Anziehung der in dem experimentellen ROI platzierten Lösung an, während ein Präferenzindexwert von -1 eine starke Abstoßung anzeigt. Ein Präferenzindex von 0,02 wurde erhalten, wenn die M13-Pufferlösung sowohl in der Kontroll- als auch in den experimentellen ROIs platziert wurde, was zeigt, dass es keine räumliche Vorspannung gegenüber entweder ROI gibt. N2-Würmer vermieden stark die Kupferionen, was zu einem Präferenzindex von -0,67 führt, was frühere Befunde bestätigt, dass Kupferionen ein starker Repellant sind ( Ergänzungsfilm 1 ) 4 . Osm-3- Mutanten, denen die korrekte Bildung der distalen Segmente der sensorischen Zilien fehlt, zeigte eine signifikant verminderte Vermeidung von Kupferionen (PI = -0,19) 15 . Ocr-2- Mutanten, die de sind<html> Fective in vielen ASH-vermittelten nozizeptiven Reaktionen einschließlich Kupfervermeidung, zeigen auch deutlich verminderte Vermeidung und sogar einige leichte Anziehung zu Kupferionen (PI = 0,19) ( Ergänzungsfilm 2 ) 16 . Fig. 3B zeigt repräsentative Wurmbelegungsdiagramme, die die Dichte der Würmer in der Steuerung gegenüber den experimentellen ROIs im Laufe der Zeit in jedem Video anzeigen. Je dunkler die Farbe des Plotbereichs ist, desto größer ist die Anzahl der Wurmpixel im ROI. Die Belegungsdarstellung für N2-Würmer, die mit der M13-Puffersteuerung behandelt wurden, zeigt, dass die Anzahl der Würmer in beiden ROIs während des gesamten Assays ähnlich bleibt. Allerdings zeigt die Belegungsdarstellung für N2-Würmer, die mit Kupferionen behandelt wurden, an, dass die Würmer den experimentellen ROI während des gesamten Assays stark und konsequent vermeiden. Gimg &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55963 / 55963fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Foto- und Schematische Darstellung des Verhaltenskammer-Designs. ( A ) Vorderansicht des Verhaltenskammeraufbaus (links) und entsprechende schematische Darstellung des Kammerrahmens (rechts). Opake Polyesterfolien umschließen die Kammer auf allen Flächen mit Ausnahme der Bodenfläche, die Licht durch die Infrarot-Hintergrundbeleuchtung ermöglicht. Die Zahlen 1, 2 und 3 entsprechen den Extrusionsschichten in (B). ( B ) Schema der Draufsicht auf Extrusionsschichten, die den Verhaltenskammerrahmen umfassen. Dies schließt die obere Schicht (1), die mittlere Kamerahalterungs-Montageschicht (2) und die untere Stufenschicht (3) ein. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig2.jpg"/&gt; Abbildung 2: Lösung-Platzierung und Plate-alignment-Vorlagen. ( A ) Die Lösung-Platzierungs-Vorlage hat vier Quadranten und Zahl-Ausrichtungsmarkierungen. Die Kontrolllösung wird in den oberen linken und unteren rechten Quadranten platziert, während die experimentelle Lösung in den oberen rechten und unteren linken Quadranten platziert wird. ( B ) Die Plattenausrichtungsschablone hat nur Nummernausrichtungsmarkierungen, um die Okklusion der Würmer im Sichtfeld während der Videoaufzeichnung und -analyse zu minimieren. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig3.jpg" /> Abbildung 3: Beispieldaten, die mit diesem Assay gesammelt wurden. ( A ) Präferenzindex (PI) -Werte für Wildtyp-N2 und Mutanten C. elegans </e<html> M&gt; als Reaktion auf M13-Puffer und 10 mM CuCl 2 . N2-Würmer zeigten keine Präferenz zwischen Kontroll- und experimentellen ROIs, wenn die M13-Kontrolllösung in beide ROIs platziert wurde, aber der experimentelle ROI stark vermieden wurde, wenn Kupferionen in sie gelegt wurden (PI = 0,02 bzw. -0,67). Osm-3 (p802) -Mutanten und ocr-2 (ak47) -Mutanten zeigten eine signifikant verminderte Vermeidung von Kupferionen im Vergleich zu N2 (PI = -0,1 bzw. 0,2). N = 6 Assays für jede Genotyp-Behandlungspaarung,&gt; 360 Würmer pro Assay, Fehlerbalken zeigen ± 1 SEM, *** p &lt;0,001, Einweg-ANOVA, gefolgt von post-hoc Tukey Ehrlich signifikanten (HSD) Test. ( B ) Repräsentative Wurmbelegungsplots für N2-Würmer mit M13-Puffer in beiden ROIs (Top) und N2-Würmern mit M13-Puffer im Kontroll-ROI und Kupfer-Ionen im experimentellen ROI (unten). Die Farbskala unterhalb jedes Belegungsplots repräsentiert die Anzahl der Wurmpixel.Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte hier klicken um eine größere Version dieser Figur zu sehen. Ergänzungsfilm 1: Verhaltensreaktion von N2-Würmern auf 10 mM Kupferchlorid. Würmer werden von den Kontrollquadranten mit M13-Puffer (oben links und unten rechts) angezogen, aber vermeiden die Quadranten, die Kupferionen enthalten, die in M13-Puffer (oben rechts und unten links) aufgelöst sind. Video wurde bei 1 Frame pro Sekunde aufgezeichnet und 15x beschleunigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_Video_1.mp4">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a> Ergänzungsfilm 2: Verhaltensreaktion von ocr-2 (ak47) Würmer bis 10 mM Kupferchlorid . Die Würmer wandern in gleichem Maße in den Kontrollquadranten mit M13-Puffer (oben links und unten rechts) und dem QuadrantenS enthaltende Kupferionen, die in M13-Puffer (oben rechts und unten links) während der Aufzeichnungsdauer aufgelöst wurden. Die Mutanten zeigen eine leichte Präferenz für die Quadranten, die Kupferionen zu Beginn der Aufzeichnung enthalten. Video wurde bei 1 Frame pro Sekunde aufgezeichnet und 15x beschleunigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_video_2.mp4">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a> Ergänzende Datei: Solution-Placement und Plate-alignment Vorlagen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/JoVE_template.pptx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay at JoVE.com

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

Wir stellen ein Verhaltensaufzeichnungs-Setup und -Protokoll vor, das eine automatisierte Analyse des Nematoden ermöglicht, Caenorhabditis elegans &#39;Präferenz für lösliche Verbindungen in einem Populations-basierten Assay. Dieser Artikel beschreibt den Aufbau einer Verhaltenskammer, das Verhaltenstestprotokoll und die Analyse der Videoanalyse.

Automatisierte Analyse eines Nematoden-Populations-basierten Chemosensorischen Präferenzassays

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