Name: automated analysis of a nematode population-based chemosensory preference assay
Uploaded: 2017-07-13T14:00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay at JoVE.com

Alcuni ceppi sono stati forniti dal Centro di Genetica di Caenorhabditis (CGC), finanziato da NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Questo lavoro è sostenuto dal Howard Hughes Medical Institute, con il quale PWS è un investigatore.

<ol>
	<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314, 1-340 (1986).</li><li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans.">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li><li>Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+responds+to+chemical+repellents+by+integrating+sensory+inputs+from+the+head+and+the+tail.">C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail.</a> Curr Biol. 12 (9), 730-734 (2002).</li><li>Hilliard, M. A., Bergamasco, C., Arbucci, S., Plasterk, R. H., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+taste+bitter:+ASH+neurons,+QUI-1,+GPA-3+and+ODR-3+mediate+quinine+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms taste bitter: ASH neurons, QUI-1, GPA-3 and ODR-3 mediate quinine avoidance in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO J. 23 (5), 1101-1111 (2004).</li><li>Zariwala, H. A., Miller, A. C., Faumont, S., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step+response+analysis+of+thermotaxis+in+Caenorhabditis+elegans.">Step response analysis of thermotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 23 (10), 4369-4377 (2003).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (3), 817-821 (1973).</li><li>Wicks, S. R., de Vries, C. J., van Luenen, H. G., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHE-3,+a+cytosolic+dynein+heavy+chain,+is+required+for+sensory+cilia+structure+and+function+in+Caenorhabditis+elegans.">CHE-3, a cytosolic dynein heavy chain, is required for sensory cilia structure and function in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 221 (2), 295-307 (2000).</li><li>Jansen, G., Weinkove, D., Plasterk, R. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+subunit+gpc-1+of+the+nematode+C.+elegans+is+involved+in+taste+adaptation.">The G-protein subunit gpc-1 of the nematode C. elegans is involved in taste adaptation.</a> EMBO J. 21 (5), 986-994 (2002).</li><li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans.">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li><li>Choe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascaroside+signaling+is+widely+conserved+among+nematodes.">Ascaroside signaling is widely conserved among nematodes.</a> Curr Biol. 22 (9), 772-780 (2012).</li><li>Ezcurra, M., Tanizawa, Y., Swoboda, P., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+sensitizes+C.+elegans+avoidance+behaviours+through+acute+dopamine+signalling.">Food sensitizes C. elegans avoidance behaviours through acute dopamine signalling.</a> EMBO J. 30 (6), 1110-1122 (2011).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nat Neurosci. 11 (8), 916-922 (2008).</li><li>Kunitomo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+memory-dependent+synaptic+plasticity+of+a+taste+circuit+regulates+salt+concentration+chemotaxis+in+Caenorhabditis+elegans.">Concentration memory-dependent synaptic plasticity of a taste circuit regulates salt concentration chemotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Commun. 4, 2210 (2013).</li><li>Snow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons.">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).</li><li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+expression+of+TRPV+channel+proteins+defines+their+sensory+functions+and+subcellular+localization+in+C.+elegans+neurons.">Combinatorial expression of TRPV channel proteins defines their sensory functions and subcellular localization in C. elegans neurons.</a> Neuron. 35 (2), 307-318 (2002).</li><li>Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+alternative+behavioral+states+by+serotonin+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans.</a> Neuron. 21 (1), 203-214 (1998).</li><li>Sawin, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans. , (1996).</li><li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parallel+worm+tracker:+A+platform+for+measuring+average+speed+and+drug-induced+paralysis+in+nematodes.">The parallel worm tracker: A platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes.</a> PLoS One. 3 (5), e2208 (2008).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans.">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat Methods. 8 (7), 592-598 (2011).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Un passo critico nel protocollo è garantire che le lastre di dosaggio abbiano un livello di asciugatura uniforme in diversi giorni sperimentali. Diversi livelli di secchezza provocheranno differenti velocità di diffusione della soluzione nell&#39;agar e, di conseguenza, variazioni nell&#39;esito comportamentale. Quindi le piastre di dosaggio dovrebbero essere sempre fresche nel pomeriggio prima di esperimenti. Il numero di worm testati per ogni analisi dovrebbe essere regolato anche per facilitare il confronto tra i trattamenti. Per riferimento, un worm di tipo selvatico mette in media 4-10 uova / h che producono&gt; 360 worm per ogni analisi se il protocollo di sincronizzazione worm è seguito 17 . Se alcuni ceppi mutanti sono difettosi di uovo, scelgono più verme adulte gravide per l&#39;uovo per raggiungere il numero di progenie. Un altro passo importante del protocollo è quello di gestire delicatamente i worm durante il processo di lavaggio e il collocamento di worm. I vermi sono sensibili agli stimoli meccanici, che suscitano risposte di stress<html> S inversioni e inibizione dell&#39;ovaio 18 . Inoltre, occorre prestare attenzione a definire con precisione il ROI e determinare il valore costante di soglia ottimale per condizioni specifiche di illuminazione prima di procedere all&#39;analisi video. Si consiglia inoltre di ripetere i processi di calibrazione e di soglia se è trascorso un lungo periodo dall&#39;ultimo esperimento. Una limitazione di questo metodo è che non è adatta per analizzare piccole popolazioni di vermi. Tuttavia, se vengono eseguiti i comandi appropriati per determinare l&#39;influenza della presenza di cibo sul comportamento sensoriale, è possibile anche utilizzare l&#39;alimento per limitare la localizzazione esplorativa spaziale dei vermi come nel dosaggio di ritenzione. Inoltre, questo metodo non è destinato a studiare la navigazione a gradiente dello stimolo a causa della vicinanza e delle piccole quantità delle gocce di controllo e di sperimentazione utilizzate. E_content &quot;&gt; In futuro, il software di programmazione che consente il tracciamento multi-worm e l&#39;estrazione funzionale di singolo worm può essere integrato in questo sistema 19 , 20. La registrazione di parametri di comportamento sottile di singoli comportamenti di worm, quali velocità di inversione e ampiezza delle curve del corpo, Un quadro più dettagliato del comportamento chemosensoriale di un singolo worm nel contesto di un dosaggio basato sulla popolazione.Il saggio può essere modificato anche per studiare l&#39;abitudine mediante fori di foratura attraverso il ROI usando aghi siringa con la dimensione del misuratore appropriato e riempendo i fori con agar infuso Con il composto sperimentale o il tampone di controllo, in modo da garantire una concentrazione superficiale più consistente del composto per un periodo di tempo più lungo di registrazione, come è necessario durante gli studi di abitudinazione.Un&#39;altra potenziale applicazione di questo metodo è condurre studi comportamentali comparativi su diverse specie di nematodi. Inoltre, la camera di comportamentoPuò essere modificato in più modi per studiare le risposte comportamentali a stimoli multimodali. Per applicazioni optogenetiche, array di LED ad alta intensità possono essere fissati accanto al supporto della fotocamera per attivare selettivamente i neuroni di interesse durante il test. Gli elementi di riscaldamento, i sistemi di raffreddamento e sensori di temperatura possono anche essere aggiunti alla configurazione per studiare gli effetti della temperatura sui comportamenti sensoriali. Inoltre, i sistemi di erogazione dell&#39;odore possono essere installati all&#39;interno della camera per studiare le interazioni tra modalità odorsensoria e chemosensoria.

Gli animali foraggiati devono integrare gli ingressi da molteplici modalità sensoriali e selezionare le appropriate strategie comportamentali per navigare con successo nell&#39;ambiente. La comprensione di come gli input sensoriali esterni vengono ricevuti e trasfusi in informazioni neurali per guidare la selezione delle azioni è un obiettivo centrale nel campo della neurobiologia. Il nematode genetico tractable, C. elegans , è un attraente modello organizzativo in cui studiare i meccanismi neurali alla base della biologia sensoriale e dell&#39;integrazione multimodale. Anche se C. elegans ha solo 302 neuroni, può rilevare e discriminare tra una grande varietà di stimoli ambientali, compresi composti solubili, odori volatili e temperatura ambiente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . IlNematode C. elegans si basa fortemente sull&#39;apparecchio chemiosensorio per localizzare le fonti alimentari e per avvisare le potenziali minacce. Pertanto, i test comportamentali progettati per esaminare le risposte di C. elegans di tipo selvatico e mutato a stimoli chimici svolgono un ruolo cruciale nella dissezione dei meccanismi genetici, cellulari e neurali sottostanti le notevoli capacità sensoriali di C. elegans . Per analizzare la risposta a composti solubili sono stati descritti tre tipi di saggi: il test a goccia, il dosaggio della chemotaxis e il saggio di ritenzione. Nel test a goccia viene posizionata una piccola goccia del composto alla coda di un verme in movimento e la decisione del verme di invertire o spostarsi in avanti una volta che il liquido raggiunge l&#39;apparato sensoriale anteriore viene valutato 4 . Il test di goccia richiede una piccola preparazione sperimentale ed è utile quando la dimensione del campione dei worm è minore, come nel caso dei worm a laser. Tuttavia, come solo un wormPuò essere analizzato alla volta e lo sperimentatore deve essere presente per tutta la durata del test, il test di caduta può richiedere molto tempo. Il test di goccia è anche vulnerabile a variazioni nella distribuzione di goccia tra ogni worm all&#39;interno di un campione, che può influenzare i risultati complessivi del dosaggio. Un&#39;altra limitazione del test di caduta è che può essere utilizzato solo per analizzare la risposta del verme ai composti avversi in quanto non è possibile discriminare tra un effetto attraente o neutro del composto dal movimento del verme in avanti. Il dosaggio di chemotaxis per composti solubili comporta generalmente la suddivisione di una piastra agar in quattro quadranti, con la soluzione sperimentale mescolata all&#39;agar di due quadranti opposti e la soluzione di controllo mescolata agli altri due quadranti 8 , 9 . All&#39;inizio del test, una goccia di tampone contenente worm è posta al centro della piastra e il numero di worm in<html> Ogni quadrante viene segnato in diversi punti temporali. Il dosaggio della chemotaxis fornisce una maggiore potenza statistica rispetto al test di caduta, in quanto vengono testati in un determinato dosaggio un gran numero di vermi. Tuttavia, una limitazione di questo metodo è che la preparazione delle piastre di dosaggio della chimotaxis richiede grandi quantità di composto sperimentale. Ciò renderà difficile eseguire schermi di comportamento su larga scala se è necessario un processo di purificazione complicato con rese limitate per ottenere il composto di interesse, come nel caso delle molecole di segnalazione ascaroside 10 . Inoltre, il conteggio manuale dei worm durante il test è suscettibile di errori e la perturbazione delle piastre durante il processo di conteggio potrebbe influenzare i risultati. A differenza dei due metodi di cui sopra, il saggio di ritenzione utilizza la visione della macchina, che minimizza l&#39;errore durante il processo di punteggio e riduce l&#39;interferenza del sperimentatore durante il saggio<html> &gt; 11. L&#39;analisi computerizzata delle registrazioni video del comportamento dei worm può anche rivelare dinamica comportamentale sottile che si mancherà quando il punteggio viene eseguito solo in alcuni punti di tempo discreti. Nel saggio di ritenzione, due punti di soluzione vengono aggiunti sui lati opposti di una piccola zona circolare di cibo batterica seguito dal posizionamento di un piccolo numero di vermi nel mezzo della patch alimentare. Il comportamento dei worms viene poi registrato, analizzato e un valore di indice di preferenza viene calcolato in base al numero totale di pixel worm in ciascuna regione di soluzione. Sebbene la presenza di una zona attraente di cibo consente di utilizzare più piccole popolazioni di vermi in ogni dosaggio, il cibo è stato precedentemente dimostrato di sensibilizzare i comportamenti di evasione a repellenti solubili 12 . Inoltre, i vermi presentano una risposta fotofobica alla luce a breve corto d&#39;onda e l&#39;uso di sorgenti luminose a microscopio che emettono luce bianca nella configurazione del comportamento di registrazione potrebbero influenzare il comportamentoS = &quot;xref&quot;&gt; 13. Lo scopo del metodo discusso in questo articolo è quello di registrare e analizzare la preferenza di C. elegans per composti solubili usando un saggio basato sulla popolazione. A tal fine, il metodo attuale integra e migliora gli aspetti di tutti e tre i metodi precedentemente discussi. Consente di testare grandi popolazioni di vermi e richiede solo piccole quantità di soluzione sperimentale da utilizzare in ogni dosaggio. Inoltre, il dosaggio viene condotto all&#39;interno di una camera di comportamento recintata personalizzata con retroilluminazione a LED a infrarossi per ridurre al minimo gli effetti della luce a corto raggio d&#39;onda sul comportamento. Ciascuna camera può anche essere dotata di fotocamere a microscopi, che aumenta il throughput sperimentale senza compromettere lo spazio del banco. Infine, il software di analisi video emette il valore dell&#39;indice di preferenza per ciascun video e una trama di occupazione del worm di accompagnamento per visualizzare la dinamica del comportamento della popolazione nel tempo. La configurazione della camera e unaIl protocollo ssay può essere ulteriormente modificato per studiare le risposte a comportamento multimodale come l&#39;effetto degli odoranti o della temperatura sui comportamenti chemiosensoriali. Questo articolo descrive la costruzione della camera di comportamento e il protocollo di analisi. Esso dimostra anche l&#39;utilità di questo metodo nel valutare la risposta di worm di tipo selvatico e mutanti difettosi chemosensori al reintensivo solubile conosciuto, ioni di rame 4 . Infine, il processo di analisi video che utilizza il software fornito è dettagliato.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Aluminum T-slotted framing extrusions</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">47065T101</td>
			<td style="width:359px;">Single profile, 1&#34; size, solid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brackets</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T236</td>
			<td>1&#34; long for 1&#34; high single profile extrusions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Compact end-feed fasteners</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T139</td>
			<td>1&#34; (single), pack of 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Twist-in solid panel holders</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T251</td>
			<td>For 1&#34; high extrusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic end caps</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T91</td>
			<td>For 1&#34; high extrusion</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Optically clear cast acrylic sheet</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">8560K211</td>
			<td>3/16&#34; thick, 12&#34; x 12&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinyl-coated polyester fabric</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">88505K57</td>
			<td>0.027&#34; thick, 61&#34; width, black</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brass grommets</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>9604K22</td>
			<td>Trade size 0, 0.545&#34; outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Steel washers</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>90107A029</td>
			<td>1/4&#34; screw size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rounded head screws</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>90272A546</td>
			<td>1/4&#34;-20 thread size, 1-1/2&#34; long</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Standard operating backlight</td>
			<td style="width:147px;">Smart Vision Lights</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td>8&#34;x8&#34;, infrared 850nm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">IVP-C1 Variable Control Pot</td>
			<td style="width:147px;">Smart Vision Lights</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">T1 Power Supply</td>
			<td style="width:147px;">Smart Vision Lights</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Dino lite Pro AM4113T</td>
			<td style="width:147px;">Dino-Lite Digital Microscope</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">MS09B microscope stand</td>
			<td style="width:147px;">Dino-Lite Digital Microscope</td>
			<td>See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated analysis of a nematode population-based chemosensory preference assay

Il nematode, il sistema nervoso compatto di Caenorhabditis elegans di soli 302 neuroni, si basa su un diverso repertorio di comportamenti. Per facilitare la dissezione dei circuiti neurali sottostanti a questi comportamenti è necessario lo sviluppo di test comportamentali robusti e riproducibili. Precedenti studi di comportamento di C. elegans hanno utilizzato varianti di &quot;test di caduta&quot;, un &quot;dosaggio di chemotaxis&quot; e un &quot;test di ritenzione&quot; per indagare la risposta di C. elegans a composti solubili. Il metodo descritto in questo articolo cerca di combinare i punti di forza complementari dei tre suddetti dosaggi. In breve, un piccolo cerchio al centro di ogni piastra di dosaggio è diviso in quattro quadranti con le soluzioni di controllo e sperimentali alternativamente posizionate. Dopo l&#39;aggiunta dei vermi, le piastre di dosaggio vengono caricate in una camera di comportamento in cui le telecamere a microscopio registrano gli incontri dei vermi con le regioni trattate. L&#39;analisi video automatica viene quindi eseguita aNd viene generato un valore di indice di preferenza (PI) per ogni video. L&#39;acquisizione video e le funzioni di analisi automatizzate di questo metodo riducono al minimo il coinvolgimento dello sperimentatore e gli eventuali errori associati. Inoltre, vengono impiegate piccole quantità del composto sperimentale per dosaggio e la configurazione multi-telecamera della camera di comportamento aumenta il throughput sperimentale. Questo metodo è particolarmente utile per condurre schermi comportamentali di mutanti genetici e nuovi composti chimici. Tuttavia, questo metodo non è appropriato per studiare la navigazione a gradiente dello stimolo a causa della stretta vicinanza delle regioni di controllo e di sperimentazione. Non dovrebbe inoltre essere utilizzato quando è disponibile solo una piccola popolazione di vermi. Mentre è idoneo per analizzare le risposte solo a composti solubili nella sua forma attuale, questo metodo può essere facilmente modificato per soddisfare l&#39;interazione sensoriale multimodale e gli studi ottogenetici. Questo metodo può anche essere adattato per analizzare le risposte chemosensoriali di altre specie di nematodi. </p&gt;

La Figura 3A mostra i valori di indice di preferenza ottenuti per accoppiamenti diversi di genotipi e di trattamento. Un valore di indice di preferenza di 1 indica una forte attrazione verso la soluzione collocata nel ROI sperimentale mentre un valore di indice di preferenza di -1 indica una forte repulsione. Un indice di preferenza di 0,02 è stato ottenuto quando la soluzione tampone M13 è stata collocata sia nei controlli ROI che nei controlli sperimentali, dimostrando che non vi è alcuna propensione spaziale verso il ROI. I vermi N2 hanno evitato fortemente gli ioni di rame che hanno portato ad un indice di preferenza di -0.67, che conferma i risultati precedenti che gli ioni di rame sono un forte repellente ( Movie Supplementary 1 ) 4 . Mutanti osm-3 , che non hanno una corretta formazione dei segmenti distali di ciglia sensoriali, hanno mostrato una riduzione significativamente ridotta degli ioni di rame (PI = -0,19) 15 . Mutanti ocr-2 , che sono de<html> In molte risposte nociceptive mediate da ASH, tra cui l&#39;evasione di rame, presentano anche una diminuzione significativa di evitamenti e anche una lieve attrazione verso gli ioni di rame (PI = 0,19) ( Supplementary Movie 2 ) 16 . La Figura 3B riporta i diagrammi rappresentativi di occupazione del worm, che indicano nel tempo la densità dei worm nel controllo rispetto ai ROI sperimentali. Più scuro è il colore dell&#39;area di disegno, maggiore è il numero di pixel di worm nel ROI. La trama di occupazione dei worm N2 trattati con il controllo tampone M13 mostra che il numero di worm in entrambi i ROI rimane simile per tutto il saggio. Tuttavia, la trama di occupazione dei vermi N2 trattati con ioni di rame indica che i worm bloccano fortemente e costantemente il ROI sperimentale durante tutto il test. Gimg &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55963 / 55963fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Rappresentazione fotografica e schematica del comportamento della camera. ( A ) Vista frontale della configurazione della camera di comportamento (a sinistra) e corrispondente rappresentazione schematica del telaio della camera (a destra). I fogli di poliestere opaco racchiudono la camera su tutte le facce, tranne la faccia inferiore, che consente la luce attraverso il pannello a infrarossi. I numeri 1, 2 e 3 corrispondono agli strati di estrusione in (B). ( B ) Schema della vista superiore degli strati di estrusione comprendente il telaio della camera di comportamento. Questo include lo strato superiore (1), lo strato di montaggio della telecamera centrale (2) e lo strato inferiore (3). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig2.jpg"/&gt; Figura 2: Modelli di posizionamento e di allineamento delle piastre. ( A ) Il modello di posizionamento della soluzione ha quattro quadranti e marcatori di allineamento numerico. La soluzione di controllo è posizionata nei quadranti destra destra e sinistra, mentre la soluzione sperimentale è posizionata nei quadranti in alto a destra e in basso a sinistra. ( B ) Il modello di allineamento delle piastre ha solo marcatori di allineamento numerico per ridurre al minimo l&#39;occlusione dei vermi nel campo visivo durante la registrazione e l&#39;analisi video. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig3.jpg" /> Figura 3: dati di esempio raccolti utilizzando questo test. ( A ) i valori di indice di preferenza (PI) per il tipo selvatico N2 e il mutante C. elegans </e<html> m&gt; in risposta al buffer M13 e 10 mM CuCl 2. I vermi N2 non hanno mostrato preferenze tra i controlli e le ROI sperimentali quando la soluzione di controllo M13 è stata collocata in entrambi i ROI ma ha fortemente evitato il ROI sperimentale quando sono stati inseriti ioni di rame (PI = 0,02 e -0,67 rispettivamente). I mutanti osm-3 (p802) e gli ocr-2 (ak47) mutanti hanno mostrato una diminuzione significativamente ridotta degli ioni di rame rispetto a N2 (PI = -0,1 e 0,2 rispettivamente). N = 6 assaggi per ogni accoppiamento di trattamento genotipo,&gt; 360 worm per assay, barre di errore indicano ± 1 SEM, *** p &lt;0,001, ANOVA a senso unico seguita da test Tukey onestamente significativa differenza (HSD) post-hoc. ( B ) Per i worm N2 con buffer M13 in entrambi i ROI (top) e N2 worm con buffer M13 nel ROI di controllo e ioni di rame nel ROI sperimentale (bottom). La scala di colore sotto ogni trama di occupazione rappresenta il numero di pixel di worm.Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Film supplementare 1: risposta comportamentale dei worm N2 a 10 mM di rame cloruro. I vermi vengono attratti dai quadranti di controllo con il buffer M13 (in alto a sinistra e in basso a destra) ma evitare fortemente i quadranti contenenti ioni di rame disciolti nel buffer M13 (in alto a destra e in basso a sinistra). Il video è stato registrato a 1 fotogramma al secondo e aumentato di 15 volte. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_Video_1.mp4">Clicca qui per scaricare questo file.</a> Film aggiuntivo 2: Responsabilità comportamentale di ocr-2 (ak47) Worms a 10 mM Cloruro di rame. I worms vagano in misura uguale in entrambi i quadranti di controllo con buffer M13 (in alto a sinistra e in basso a destra) e il quadranteContenenti ioni di rame disciolti nel buffer M13 (in alto a destra e in basso a sinistra) durante la durata della registrazione. I mutanti presentano una leggera preferenza per i quadranti contenenti ioni di rame all&#39;inizio della registrazione. Il video è stato registrato a 1 fotogramma al secondo e aumentato di 15 volte. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_video_2.mp4">Clicca qui per scaricare questo file.</a> File aggiuntivo: Modelli di soluzioni e modelli di allineamento delle piastre. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/JoVE_template.pptx">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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