Name: automated analysis of a nematode population-based chemosensory preference assay
Uploaded: 2017-07-13T14:00:00
Duration: 9 min 44 s
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Algunas cepas fueron proporcionadas por el Caenorhabditis Genetics Center (CGC), que es financiado por NIH Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación (P40 OD010440). Este trabajo es apoyado por el Instituto Médico Howard Hughes, con el cual PWS es un investigador.

<ol>
	<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314, 1-340 (1986).</li><li>Bargmann, C. I., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+neurons+with+overlapping+functions+direct+chemotaxis+to+multiple+chemicals+in+C.+elegans.">Chemosensory neurons with overlapping functions direct chemotaxis to multiple chemicals in C. elegans.</a> Neuron. 7 (5), 729-742 (1991).</li><li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans.">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li><li>Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C.+elegans+responds+to+chemical+repellents+by+integrating+sensory+inputs+from+the+head+and+the+tail.">C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail.</a> Curr Biol. 12 (9), 730-734 (2002).</li><li>Hilliard, M. A., Bergamasco, C., Arbucci, S., Plasterk, R. H., Bazzicalupo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+taste+bitter:+ASH+neurons,+QUI-1,+GPA-3+and+ODR-3+mediate+quinine+avoidance+in+Caenorhabditis+elegans.">Worms taste bitter: ASH neurons, QUI-1, GPA-3 and ODR-3 mediate quinine avoidance in Caenorhabditis elegans.</a> EMBO J. 23 (5), 1101-1111 (2004).</li><li>Zariwala, H. A., Miller, A. C., Faumont, S., Lockery, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Step+response+analysis+of+thermotaxis+in+Caenorhabditis+elegans.">Step response analysis of thermotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> J Neurosci. 23 (10), 4369-4377 (2003).</li><li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants.">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (3), 817-821 (1973).</li><li>Wicks, S. R., de Vries, C. J., van Luenen, H. G., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHE-3,+a+cytosolic+dynein+heavy+chain,+is+required+for+sensory+cilia+structure+and+function+in+Caenorhabditis+elegans.">CHE-3, a cytosolic dynein heavy chain, is required for sensory cilia structure and function in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 221 (2), 295-307 (2000).</li><li>Jansen, G., Weinkove, D., Plasterk, R. H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein+subunit+gpc-1+of+the+nematode+C.+elegans+is+involved+in+taste+adaptation.">The G-protein subunit gpc-1 of the nematode C. elegans is involved in taste adaptation.</a> EMBO J. 21 (5), 986-994 (2002).</li><li>Srinivasan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+blend+of+small+molecules+regulates+both+mating+and+development+in+Caenorhabditis+elegans.">A blend of small molecules regulates both mating and development in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 454 (7208), 1115-1118 (2008).</li><li>Choe, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ascaroside+signaling+is+widely+conserved+among+nematodes.">Ascaroside signaling is widely conserved among nematodes.</a> Curr Biol. 22 (9), 772-780 (2012).</li><li>Ezcurra, M., Tanizawa, Y., Swoboda, P., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Food+sensitizes+C.+elegans+avoidance+behaviours+through+acute+dopamine+signalling.">Food sensitizes C. elegans avoidance behaviours through acute dopamine signalling.</a> EMBO J. 30 (6), 1110-1122 (2011).</li><li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans.">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nat Neurosci. 11 (8), 916-922 (2008).</li><li>Kunitomo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration+memory-dependent+synaptic+plasticity+of+a+taste+circuit+regulates+salt+concentration+chemotaxis+in+Caenorhabditis+elegans.">Concentration memory-dependent synaptic plasticity of a taste circuit regulates salt concentration chemotaxis in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Commun. 4, 2210 (2013).</li><li>Snow, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+anterograde+intraflagellar+transport+motors+cooperate+to+build+sensory+cilia+on+C.+elegans+neurons.">Two anterograde intraflagellar transport motors cooperate to build sensory cilia on C. elegans neurons.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1109-1113 (2004).</li><li>Tobin, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combinatorial+expression+of+TRPV+channel+proteins+defines+their+sensory+functions+and+subcellular+localization+in+C.+elegans+neurons.">Combinatorial expression of TRPV channel proteins defines their sensory functions and subcellular localization in C. elegans neurons.</a> Neuron. 35 (2), 307-318 (2002).</li><li>Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+alternative+behavioral+states+by+serotonin+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans.</a> Neuron. 21 (1), 203-214 (1998).</li><li>Sawin, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans. , (1996).</li><li>Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L., Carnell, L., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+parallel+worm+tracker:+A+platform+for+measuring+average+speed+and+drug-induced+paralysis+in+nematodes.">The parallel worm tracker: A platform for measuring average speed and drug-induced paralysis in nematodes.</a> PLoS One. 3 (5), e2208 (2008).</li><li>Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+behavioral+analysis+in+C.+elegans.">High-throughput behavioral analysis in C. elegans.</a> Nat Methods. 8 (7), 592-598 (2011).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Un paso crítico en el protocolo es asegurar que las placas de ensayo tengan un nivel consistente de sequedad a través de diferentes días experimentales. Diferentes niveles de sequedad resultarán en diferentes velocidades de difusión de la solución en el agar y, en consecuencia, variaciones en el resultado del comportamiento. Por lo tanto, las placas de ensayo siempre deben estar frescas en la tarde antes de los experimentos. El número de gusanos ensayados por ensayo también debe ser regulado para facilitar la comparación entre los tratamientos. Para referencia, un gusano de tipo salvaje pone 4-10 huevos / h en promedio produciendo&gt; 360 gusanos por ensayo si se sigue el protocolo de sincronización del gusano anterior 17 . Si ciertas cepas mutantes están defec- tando huevos, recoja más gusanos adultos grávidos para la puesta de huevos para alcanzar el número objetivo de progenie. Otro paso importante en el protocolo es manejar los gusanos suavemente durante el proceso de lavado y la colocación del gusano. Los gusanos son sensibles a los estímulos mecánicos, que provocan respuestas de<html> S y la inhibición de la deposición de huevos 18 . Además, se debe tener cuidado de definir el ROI con precisión y determinar el valor óptimo de umbral constante para condiciones de iluminación específicas antes de continuar con el análisis de vídeo. También se recomienda repetir los procesos de calibración y de umbral si ha transcurrido un período de tiempo prolongado desde el último experimento. Una limitación de este método es que no es adecuado para ensayar pequeñas poblaciones de gusanos. Sin embargo, si se llevan a cabo los controles apropiados para determinar la influencia de la presencia de alimentos en el comportamiento sensorial, también es posible utilizar alimentos para restringir la localización exploratoria espacial de los gusanos como en el ensayo de retención. Además, este método no está destinado a estudiar la navegación por gradiente de estímulo debido a la proximidad y pequeñas cantidades de las gotas de solución de control y experimentales utilizadas. E_content &quot;&gt; En el futuro, el software de programación que permite el rastreo multi-gusano y la extracción de características de gusano único se pueden integrar en este sistema 19 , 20. La grabación de parámetros sutiles de comportamiento de un solo gusano, tales como velocidades de inversión y amplitud de curvas Un cuadro más detallado de la conducta quimiosensorial de un gusano individual en el contexto de un ensayo basado en la población.El ensayo también puede modificarse para estudiar la habituación perforando agujeros a través del ROI utilizando agujas de jeringa con el tamaño de calibre apropiado y llenar los agujeros con agar infundido Con el compuesto experimental o el tampón de control Esto asegurará una concentración superficial más consistente del compuesto durante un período de tiempo de registro más largo como sea necesario durante los estudios de habituación Otra aplicación potencial de este método es conducir estudios de comportamiento comparativos a través de diferentes especies de nematodos. Además, la cámara de comportamientoPueden modificarse de múltiples maneras para estudiar las respuestas conductuales a los estímulos multimodales. Para aplicaciones optogenéticas, se pueden conectar matrices LED de alta intensidad junto al montaje de la cámara para activar selectivamente neuronas de interés durante el ensayo. Elementos calefactores, sistemas de refrigeración y sensores de temperatura también se pueden agregar a la configuración para estudiar los efectos de la temperatura en los comportamientos sensoriales. Además, los sistemas de suministro de olores pueden instalarse dentro de la cámara para investigar las interacciones entre las modalidades odorsensorial y quimiosensorial.

Los animales forrajeros deben integrar insumos de múltiples modalidades sensoriales y seleccionar estrategias de comportamiento apropiadas para poder navegar con éxito en su ambiente. La comprensión de cómo los insumos sensoriales externos se reciben y transduced en la información neural para guiar la selección de la acción es una meta central en el campo de la neurobiología. El nematodo genéticamente tratable, C. elegans , es un organismo modelo atractivo en el que estudiar los mecanismos neuronales subyacentes biología sensorial y la integración multimodal. Aunque C. elegans tiene sólo 302 neuronas, puede detectar y discriminar entre una amplia variedad de estímulos ambientales, incluyendo compuestos solubles, olores volátiles y temperatura ambiente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . losNematodo C. elegans depende en gran medida de su aparato quimiosensorial para localizar las fuentes de alimentos y para alertar a las amenazas potenciales. Así, los ensayos conductuales diseñados para examinar las respuestas de C. elegans de tipo salvaje y mutante a estímulos químicos desempeñan un papel crucial en la disección de los mecanismos genéticos, celulares y neuronales que subyacen a las notables capacidades sensoriales de C. elegans . Para ensayar la respuesta a compuestos solubles, se han descrito tres tipos de ensayos: el ensayo de caída, el ensayo de quimiotaxis y el ensayo de retención. En la prueba de caída, se coloca una pequeña gota del compuesto en la cola de un gusano móvil y la decisión del gusano de retroceder o avanzar una vez que el líquido alcanza el aparato sensorial anterior se anota 4 . La prueba de caída requiere poca preparación experimental y es útil cuando el tamaño de la muestra de los gusanos es pequeño, como en el caso de los gusanos operados por láser. Sin embargo, como sólo un gusanoPuede ensayarse a la vez y el experimentador debe estar presente a lo largo de la duración del ensayo, la prueba de caída puede llevar mucho tiempo. La prueba de caída es también vulnerable a variaciones en el suministro de gotas entre cada gusano dentro de una muestra, lo que puede influir en los resultados globales del ensayo. Otra limitación de la prueba de caída es que sólo puede usarse para analizar la respuesta del gusano a compuestos aversivos ya que no es posible discriminar entre un efecto atractivo o neutro del compuesto del movimiento hacia delante del gusano. El ensayo de quimiotaxis para compuestos solubles generalmente implica dividir una placa de agar en cuatro cuadrantes, con la solución experimental mezclada en el agar de dos cuadrantes opuestos y la solución de control mezclada en los otros dos cuadrantes 8 , 9 . Al comienzo del ensayo, se coloca una gota de gusano conteniendo tampón en el centro de la placa y el número de gusanos en<html> Cada cuadrante se anota en diferentes puntos temporales. El ensayo de quimiotaxis proporciona mayor poder estadístico en comparación con la prueba de caída, ya que se ensaya un gran número de gusanos en cada ensayo. Sin embargo, una limitación de este método es que la preparación de las placas de ensayo de quimiotaxis requiere grandes cantidades del compuesto experimental. Esto dificultará la realización de pantallas de comportamiento a gran escala si se requiere un complicado proceso de purificación con rendimientos limitados para obtener el compuesto de interés, como en el caso de las moléculas de señalización de ascarósido 10 . Además, el conteo manual de gusanos durante todo el ensayo es susceptible a errores y la perturbación de las placas durante el proceso de conteo puede afectar los resultados. A diferencia de los dos métodos antes mencionados, el ensayo de retención utiliza visión mecánica, que minimiza el error durante el proceso de puntuación y reduce la interferencia del experimentador durante el ensayo<html> &gt; 11. El análisis computarizado de las grabaciones de vídeo del comportamiento del gusano también puede revelar potencialmente una dinámica de comportamiento más sutil que se perderá cuando la puntuación se realiza sólo en unos pocos puntos de tiempo discretos. En el ensayo de retención, se añaden dos puntos de solución en lados opuestos de un pequeño parche alimentario circular bacteriano seguido por la colocación de un pequeño número de gusanos en el medio del parche de alimentos. El comportamiento de los gusanos es grabado y analizado, y se calcula un valor de índice de preferencia basado en el número total de píxeles de gusano en cada región de solución. Aunque la presencia de un parche de alimentos atractivos permite que se utilicen poblaciones de gusanos más pequeñas en cada ensayo, previamente se ha demostrado que los alimentos sensibilizan los comportamientos de evitación a los repelentes solubles 12 . Además, los gusanos muestran una respuesta fotofóbica a la luz de longitud de onda corta y el uso de fuentes de luz de microscopio que emiten luz blanca en la configuración de grabación de comportamiento podría afectar el comportamientoS = &quot;xref&quot;&gt; 13. El propósito del método discutido en este artículo es registrar y analizar la preferencia de C. elegans por los compuestos solubles usando un ensayo basado en la población. Con este fin, el método actual se integra y mejora aspectos de los tres métodos anteriormente discutidos. Permite que se ensayen grandes poblaciones de gusanos y sólo se requieren pequeñas cantidades de la solución experimental en cada ensayo. Además, el ensayo se lleva a cabo dentro de una cámara de comportamiento cerrada personalizada con retroiluminación LED infrarrojo para minimizar los efectos de la luz de longitud de onda corta en el comportamiento. Cada cámara también puede equiparse con múltiples cámaras de microscopio, lo que aumenta el rendimiento experimental sin comprometer el espacio del banco. Por último, el software de análisis de vídeo genera el valor del índice de preferencia para cada vídeo, así como un gráfico de ocupación del gusano que lo acompaña para visualizar la dinámica del comportamiento de la población con el tiempo. El montaje de la cámara yEl protocolo ssay puede modificarse adicionalmente para estudiar las respuestas de comportamiento multimodal, tales como el efecto de los odorantes o la temperatura en los comportamientos quimiosensores. Este artículo describe la construcción de la cámara de comportamiento y el protocolo de ensayo. También demuestra la utilidad de este método en el ensayo de la respuesta de gusanos de tipo salvaje y mutantes defectuosos quimiosensoriales a los cono conocidos repelente, iones de cobre [ 4] . Por último, se detalla el proceso de análisis de vídeo que utiliza el software proporcionado.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Aluminum T-slotted framing extrusions</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">47065T101</td>
			<td style="width:359px;">Single profile, 1&#34; size, solid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brackets</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T236</td>
			<td>1&#34; long for 1&#34; high single profile extrusions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Compact end-feed fasteners</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T139</td>
			<td>1&#34; (single), pack of 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Twist-in solid panel holders</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T251</td>
			<td>For 1&#34; high extrusion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Plastic end caps</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>47065T91</td>
			<td>For 1&#34; high extrusion</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Optically clear cast acrylic sheet</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">8560K211</td>
			<td>3/16&#34; thick, 12&#34; x 12&#34;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vinyl-coated polyester fabric</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td style="width:119px;">88505K57</td>
			<td>0.027&#34; thick, 61&#34; width, black</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brass grommets</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>9604K22</td>
			<td>Trade size 0, 0.545&#34; outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Steel washers</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>90107A029</td>
			<td>1/4&#34; screw size</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rounded head screws</td>
			<td style="width:147px;">McMaster-Carr</td>
			<td>90272A546</td>
			<td>1/4&#34;-20 thread size, 1-1/2&#34; long</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Standard operating backlight</td>
			<td style="width:147px;">Smart Vision Lights</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td>8&#34;x8&#34;, infrared 850nm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">IVP-C1 Variable Control Pot</td>
			<td style="width:147px;">Smart Vision Lights</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">T1 Power Supply</td>
			<td style="width:147px;">Smart Vision Lights</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Dino lite Pro AM4113T</td>
			<td style="width:147px;">Dino-Lite Digital Microscope</td>
			<td style="width:119px;">See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">MS09B microscope stand</td>
			<td style="width:147px;">Dino-Lite Digital Microscope</td>
			<td>See local vendor</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

automated analysis of a nematode population-based chemosensory preference assay

El nematodo, el sistema nervioso compacto de Caenorhabditis elegans de sólo 302 neuronas subyace en un repertorio diverso de comportamientos. Para facilitar la disección de los circuitos neuronales subyacentes a estos comportamientos, es necesario el desarrollo de ensayos de comportamiento robustos y reproducibles. Anterior C. elegans estudios de comportamiento han utilizado variaciones de un &quot;test de caída&quot;, un &quot;ensayo de quimiotaxis&quot;, y un &quot;ensayo de retención&quot; para investigar la respuesta de C. elegans a compuestos solubles. El método descrito en este artículo busca combinar las fuerzas complementarias de los tres ensayos antes mencionados. Brevemente, un pequeño círculo en el centro de cada placa de ensayo se divide en cuatro cuadrantes con las soluciones de control y experimentales colocadas alternativamente. Después de la adición de los gusanos, las placas de ensayo se cargan en una cámara de comportamiento donde las cámaras de microscopio registran los encuentros de los gusanos con las regiones tratadas. El análisis automatizado de video seY se genera un valor de índice de preferencia (PI) para cada vídeo. La adquisición de vídeo y las características de análisis automatizado de este método minimizan la participación del experimentador y cualquier error asociado. Además, se utilizan cantidades minuciosas del compuesto experimental por ensayo y la configuración de múltiples cámaras de la cámara de comportamiento aumenta el rendimiento experimental. Este método es particularmente útil para conducir pantallas de comportamiento de mutantes genéticos y nuevos compuestos químicos. Sin embargo, este método no es apropiado para estudiar la navegación por gradiente de estímulo debido a la proximidad cercana de las regiones de control y solución experimental. Tampoco debe utilizarse cuando sólo se dispone de una pequeña población de gusanos. Aunque es adecuado para ensayar respuestas sólo a compuestos solubles en su forma actual, este método puede modificarse fácilmente para adaptarse a interacciones sensoriales multimodales y estudios optogenéticos. Este método también puede adaptarse para ensayar las respuestas quimiosensibles de otras especies de nemátodos. </P

La Figura 3A muestra los valores del índice de preferencia obtenidos para diferentes genotipos y parejas de tratamiento. Un valor de índice de preferencia de 1 indica una atracción fuerte a la solución colocada en el ROI experimental, mientras que un valor de índice de preferencia de -1 indica fuerte repulsión. Se obtuvo un índice de preferencia de 0,02 cuando la solución tampón M13 se colocó tanto en el ROI control como en el ROI experimental, lo que demuestra que no existe un sesgo espacial hacia ROI. N2 worms fuertemente evitado los iones de cobre, resultando en un índice de preferencia de -0,67, lo que corrobora hallazgos anteriores de que los iones de cobre son un repelente fuerte ( Película Suplementaria 1 ) 4 . Osm-3 mutantes, que carece de formación adecuada de los segmentos distales de los cilios sensoriales, mostró una disminución significativamente disminución de los iones de cobre (PI = -0,19) [ 15] . Ocr-2 mutantes, que son de<html> Fective en muchas respuestas nociceptivas mediadas por ASH, incluyendo la evitación de cobre, también muestran una disminución significativa de la evitación e incluso alguna atracción leve a los iones de cobre (PI = 0,19) ( Película Suplementaria 2 ) 16 . La Figura 3B muestra parcelas representativas de ocupación de gusanos, que indican la densidad de gusanos en el control frente a los ROI experimentales a lo largo del tiempo en cada video. Cuanto más oscuro sea el color del área de trazado, mayor será el número de píxeles de gusano en el ROI. El gráfico de ocupación para los gusanos N2 tratados con el control del tampón M13 muestra que el número de gusanos en ambos ROI sigue siendo similar a lo largo del ensayo. Sin embargo, la parcela de ocupación para los gusanos N2 tratados con iones de cobre indica que los gusanos fuerte y consistentemente evitar el retorno de la inversión experimental en todo el ensayo. Gimg &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55963 / 55963fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Representación fotográfica y esquemática del diseño de cámara de comportamiento. ( A ) Vista frontal de la disposición de cámara de comportamiento (izquierda) y representación esquemática correspondiente del marco de cámara (derecha). Las hojas opacas de poliéster encierran la cámara en todas las caras excepto la cara inferior, que permite la luz a través del panel de luz de fondo infrarrojo. Los números 1, 2 y 3 corresponden a las capas de extrusión en (B). ( B ) Esquema de vista desde arriba de capas de extrusión que comprenden el marco de cámara de comportamiento. Esto incluye la capa superior (1), la capa de ensamblaje de montaje de cámara central (2) y la capa de etapa inferior (3). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig2.jpg"/&gt; Figura 2: Plantillas de colocación de solución y de alineación de placas. ( A ) La plantilla de colocación de solución tiene cuatro cuadrantes y marcadores de alineación de números. La solución de control se coloca en los cuadrantes superior izquierdo e inferior derecho mientras que la solución experimental se coloca en los cuadrantes superior derecho e inferior izquierdo. ( B ) La plantilla de alineación de placas tiene solamente marcadores de alineación de números para minimizar la oclusión de los gusanos en el campo de visión durante la grabación y análisis de vídeo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/55963fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55963/55963fig3.jpg" /> Figura 3: Ejemplo de datos recopilados utilizando este ensayo. ( A ) valores del Índice de Preferencia (PI) para el N2 de tipo salvaje y C. elegans mutante </e<html> M&gt; en respuesta a tampón M13 y CuCl $ ₂ $ 10 mM. Los gusanos N2 no mostraron ninguna preferencia entre el control y los ROIs experimentales cuando la solución de control M13 se colocó en ambos ROI, pero evitó fuertemente el retorno de la inversión experimental cuando se colocaron iones de cobre (PI = 0,02 y -0,67, respectivamente). Osm-3 (p802) mutantes y ocr-2 (ak47) mutantes mostró significativamente disminución evitación de los iones de cobre en comparación con N2 (PI = -0,1 y 0,2, respectivamente). N = 6 ensayos para cada par de genotipo-tratamiento,&gt; 360 gusanos por ensayo, las barras de error indican ± 1 SEM, *** p &lt;0,001, ANOVA unidireccional seguido de la prueba Tukey Hichamly Significant Difference (HSD) post-hoc. ( B ) Parcelas de ocupación de gusanos representativas para gusanos N2 con tampón M13 en ROIs (superior) y gusanos N2 con tampón M13 en el ROI de control y iones de cobre en el ROI experimental (parte inferior). La escala de color por debajo de cada gráfico de ocupación representa el número de píxeles de gusano.Pload / 55963 / 55963fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Película suplementaria 1: respuesta conductual de los gusanos N2 a cloruro de cobre 10 mM. Los gusanos se atraen a los cuadrantes de control con tampón M13 (superior izquierdo e inferior derecho), pero evitan fuertemente los cuadrantes que contienen iones de cobre disueltos en tampón M13 (superior derecha e inferior izquierda). El video se grabó a 1 fotograma por segundo y aceleró 15x. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_Video_1.mp4">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a> Película complementaria 2: Respuesta conductual de los gusanos ocr-2 (ak47) a cloruro de cobre 10 mM. Los gusanos vagan hasta una extensión aproximadamente igual en ambos cuadrantes de control con tampón M13 (superior izquierdo e inferior derecho) y el cuadranteS que contienen iones de cobre disueltos en tampón M13 (superior derecha e inferior izquierda) a lo largo de la duración de la grabación. Los mutantes muestran una ligera preferencia por los cuadrantes que contienen iones de cobre al comienzo de la grabación. El video se grabó a 1 fotograma por segundo y aceleró 15x. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/Supplementary_video_2.mp4">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a> Archivo suplementario: Plantillas de colocación de solución y alineación de plantillas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55963/JoVE_template.pptx">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

Presentamos una configuración de grabación de comportamiento y un protocolo que permite el análisis automatizado del nematodo, la preferencia de Caenorhabditis elegans por compuestos solubles en un ensayo basado en la población. Este artículo describe la construcción de una cámara de comportamiento, el protocolo de ensayo conductual y el uso de software de análisis de vídeo.

Análisis Automatizado de un Ensayo de Preferencia Chemosensorial Basada en Población de Nematodo

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