Name: a method for characterizing embryogenesis in arabidopsis
Uploaded: 2017-08-04T10:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis at JoVE.com

אנו מודים ד ר ג ' סיקה Habashi על קריאה ביקורתית של כתב היד. אנו מודים דוקטור שנג Xianyong של מרכז הדמיה, המכללה למדעי החיים, אוניברסיטת הון (בייג'ינג, סין), על ביצוע הלוקליזציה של DR5-GFP וזמינותו. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים של קרן המדע בייג'ינג הממשל העירוני (CIT &#38; TCD20150102) את נבחרת מדעי הטבע קרן של סין וממנה (31600248).

הערה: פרוטוקול זה יש שלושה חלקים: 1) התבוננות היווצרות תבנית בפראי-סוג תודרנית עוברי באמצעות מיקרוסקופ DIC; 2) אפיון של העובר דפוס היווצרות דרך התבוננות סמן ביטוי חלבון באמצעות לייזר קונפוקלי סורק מיקרוסקופ; ו 3) קביעת התפקיד של גן מסוים ב מופרה (באמצעות המוטציה naa10 בתור דוגמה)....

<ol>
	<li>Jenik, P. D., Gillmor, C. S., Lukowitz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+patterning+in+Arabidopsis+thaliana.">Embryonic patterning in Arabidopsis thaliana.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 207-236 (2007).</li><li>Lau, S., Slane, D., Herud, O., Kong, J., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+embryogenesis+in+flowering+plants:+setting+up+the+basic+body+pattern.">Early embryogenesis in flowering plants: setting up the basic body pattern.</a> Annu Rev Plant Biol. 63, 483-506 (2012).</li><li>Wendrich, J. R., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+embryo+as+a+miniature+morphogenesis+model.">The Arabidopsis embryo as a miniature morphogenesis model.</a> New Phytol. 199 (1), 14-25 (2013).</li><li>ten Hove, C. A., Lu, K. J., Weijers, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+a+plant:+cell+fate+specification+in+the+early+Arabidopsis+embryo.">Building a plant: cell fate specification in the early Arabidopsis embryo.</a> Development. 142 (3), 420-430 (2015).</li><li>Feng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+N-terminal+acetylation+is+required+for+embryogenesis+in+Arabidopsis.">Protein N-terminal acetylation is required for embryogenesis in Arabidopsis.</a> J Exp Bot. 67 (15), 4779-4789 (2016).</li><li>Berleth, T., Jurgens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+monopteros+gene+in+organising+the+basal+body+region+of+the+Arabidopsis+embryo.">The role of the monopteros gene in organising the basal body region of the Arabidopsis embryo.</a> Development. 118, 575-587 (1993).</li><li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D-myo-inositol-3-phosphate+affects+phosphatidylinositol-mediated+endomembrane+function+in+Arabidopsis+and+is+essential+for+auxin-regulated+embryogenesis.">D-myo-inositol-3-phosphate affects phosphatidylinositol-mediated endomembrane function in Arabidopsis and is essential for auxin-regulated embryogenesis.</a> Plant Cell. 23 (4), 1352-1372 (2011).</li><li>Nodine, M. D., Yadegari, R., Tax, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPK1+and+TOAD2+are+two+receptor-like+kinases+redundantly+required+for+Arabidopsis+embryonic+pattern+formation.">RPK1 and TOAD2 are two receptor-like kinases redundantly required for Arabidopsis embryonic pattern formation.</a> Dev Cell. 12 (6), 943-956 (2007).</li><li>Ulmasov, T., Murfett, J., Hagen, G., Guilfoyle, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aux/IAA+proteins+repress+expression+of+reporter+genes+containing+natural+and+highly+active+synthetic+auxin+response+elements.">Aux/IAA proteins repress expression of reporter genes containing natural and highly active synthetic auxin response elements.</a> Plant Cell. 9 (11), 1963-1971 (1997).</li><li>Friml, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efflux-dependent+auxin+gradients+establish+the+apical-basal+axis+of+Arabidopsis.">Efflux-dependent auxin gradients establish the apical-basal axis of Arabidopsis.</a> Nature. 426 (6963), 147-153 (2003).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16 (16), 735-743 (1998).</li><li>Fiume, E., Fletcher, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Arabidopsis+embryo+and+endosperm+development+by+the+polypeptide+signaling+molecule+CLE8.">Regulation of Arabidopsis embryo and endosperm development by the polypeptide signaling molecule CLE8.</a> Plant Cell. 24 (3), 1000-1012 (2012).</li><li>Jurkuta, R. J., Kaplinsky, N. J., Spindel, J. E., Barton, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partitioning+the+apical+domain+of+the+Arabidopsis+embryo+requires+the+BOBBER1+NudC+domain+protein.">Partitioning the apical domain of the Arabidopsis embryo requires the BOBBER1 NudC domain protein.</a> Plant Cell. 21 (21), 1957-1971 (2009).</li></ol>

סיווג ביצית היא שיטה שימושית עבור חלוקת התאים ולהתאושש להערכת המורפולוגיה במהלך מופרה ב תודרנית; בעזרת טכניקה זו, העוברים יכול להיות שנצפו ישירות מתחת DIC מיקרוסקופ5,12. השלב הקריטי לאישור ביצית היא צעד 1.3.4. הזמן הנדרש לאישור ביצית בשלב 1.3.4 הוא משתנה. העוב?...

מופרה הוא האירוע המוקדם ביותר בהתפתחות הצמח גבוה יותר. טפסים העובר בוגר מ זיגוטה דרך חלוקת התא ובידול תחת בקרת גנטי קפדנית1,2. תודרנית העוברים הם מודל שימושי ללמוד את השליטה מורפוגנזה כי הרצף של חלוקות תאים במהלך מופרה עוקב אחר3,דפוס הצפויות4. אולם, העובר תודרנית המכיל מספר תאים אחד הוא קטן מדי כדי להיות שנצפו וניתח. בנוסף, המוטציה של גנים מסוימים יכולים לגרום העובר lethality5, המציינת את התפקיד של הגנים האלה ב מופרה. האפיון של דפוס-צורה מוטנטים קטלניים העובר מספק בסיס להבנת המנגנון המולקולרי לפיה גנים חיוניים לווסת את התפתחות העובר.
שיטה מפורטת מתואר כאן על האפיון של היווצרות העובר דפוס בצמח דגם תודרנית באמצעות התבוננות מיקרוסקופית ישירה. השיטה כוללת סיווג ביצית ואחריו התצפית מיקרוסקופיים של העובר. אפיון מוטנטים קטלניים העובר גם מתואר.
המורפולוגיה של עוברי בשלבים התפתחותיים שונים יכול להיקבע ישירות על ידי מיקרוסקופ באמצעות ovules זה נוקו עם שותפה עסקית של פתרון6,7. כזה ovules התערוכה של השבירה הגבוה במדד; לכן, זה ביצית ניקוי בשיטה הוא מועיל במיוחד דגימות שאינן יש להקפיד על ידי מיקרוסקופ ניגודיות (DIC) התערבות דיפרנציאלית.
בנוסף, הגנים מבוטאים לתא מסוים או במספר מצומצם של תאים במהלך מופרה יכול לשמש סמנים לזיהוי תאי העובר. לכן, יכול להיות מבואר המפרט זהות תא במהלך מופרה על-ידי ניטור הביטוי של חלבונים מתויג GFP סמן באמצעות סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. לעומת זאת, התבוננות למשמעות הביטוי גן פונקציונלי unknown -GFP פיוז'ן במהלך מופרה יכול מספקים קישור בין העובר המתבנת הביטוי של הגן הזה, להקל על זיהוי גנים חדשים הדרושים מופרה ב תודרנית.
השיטה המתוארת כאן יכול לשמש גם כדי לאפיין את פנוטיפ של מוטציה העובר-קטלני, וכדי לקבוע את ההשפעה של הגן המושפעים על מופרה ברמה התאית. יתר על כן, בשילוב עם השוואה של התבנית ביטוי של גנים סמן במהלך מופרה בין הצמחים פראי-סוג של מוטציה, השיטה ניתן תשואות רמזים אודות המנגנונים המולקולריים המעורבים מופרה8,9. אכן, השיטה היה מוחל על צמחים naa10 , התברר כי החלוקה לא נורמלי של hypophysis ב החשבונאי שעלול להיגרם שינוי בחלוקת אוקסין במהלך מופרה5.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="847">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Chloral Hydrate</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">15307</td>
			<td style="width:293px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Murashige and Skoog Basal Medium</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>M5519</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Phytagel</td>
			<td style="width:155px;">Sigma</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">Hygromycin&#160;</td>
			<td>Roche</td>
			<td>10843555001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Growth chamber&#160;</td>
			<td>Percival</td>
			<td style="width:119px;">CU36L5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss Oberkochen</td>
			<td>Zeiss Image M2</td>
			<td>camera: AxioCam 506 color</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal Laser Scanning Microscopy</td>
			<td>Zeiss Oberkochen</td>
			<td>Zeiss LSM 5</td>
			<td>filters: BP 495-555 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stereoscope</td>
			<td>Zeiss Oberkochen</td>
			<td>Axio Zoom V16</td>
			<td>camera: AxioCam MRc5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">nutrient-rich&#160;soil</td>
			<td colspan="2">KLASMANN, Germany</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50-ml tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1.5-ml tube</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:281px;">10% sodium hypochlorite solution</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sucrose</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KOH</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycerol</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic analytical reagent</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">culture dish</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">vermiculite</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glass slide</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">syringe needle</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fine-tipped tweezers</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">super clean bench</td>
			<td style="width:155px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>&#160;Domestic equipment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for characterizing embryogenesis in arabidopsis

בהתחשב באופי מאוד לחיזוי ההתפתחות שלהם, העוברים תודרנית שימשו כמודל ללימודי של מורפוגנזה בצמחים. עם זאת, עוברים בשלב מוקדם של הצמח הבמה הם קטנים ומכילים כמה תאים, שהופך אותם קשה להתבונן ולנתח. שיטה מתואר כאן על אפיון הדפוס-צורה צמח העוברים תחת מיקרוסקופ באמצעות האורגניזם דגם תודרנית. בעקבות פינוי של טרי ovules באמצעות הפתרון של שותפה עסקית, יכול להיות שנצפו תא במספר של המורפולוגיה של העוברים ולאחר השלב ההתפתחותי שלהם יכול להיקבע על ידי התערבות דיפרנציאלית ניגודיות מיקרוסקופ באמצעות 100 X עדשה טבילה שמן. בנוסף, הביטוי של חלבונים ספציפיים סמן מתויג עם ירוק ניאון חלבון (GFP) נוטרה כדי להוסיף ביאורים תא מפרט זהות במהלך המתבנת העובר על ידי סריקת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. לכן, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לצפות דפוס-צורה פראי-סוג צמח עוברי ברמות תאית ומולקולרית, לאפיין את התפקיד של גנים ספציפיים בהמתבנת העובר על-ידי השוואת צורה דפוס העוברים בין פראי-סוג צמחים מוטנטים קטלניים העובר. לכן, השיטה ניתן לאפיין מופרה ב תודרנית.

השיטה המתוארת במאמר זה יכול לשמש כדי להתבונן מופרה ישירות תחת מיקרוסקופ, ביאור המפרט את הזהות תא במהלך מופרה עם סמנים ספציפי לאפיין את התפקיד של גן מסוים במהלך מופרה.
נציג תוצאות הניתוח של העובר תכנים (החל משלב זיגוטה מוארך לבמה מקל ההליכ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis at JoVE.com

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

פרוטוקול זה מתאר שיטת התבוננות מופרה ב תודרנית באמצעות סיווג ביצית ואחריו את הבדיקה של היווצרות תבנית העובר תחת מיקרוסקופ.

שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

שיטה של ​​לימוד Palatal היתוך באמצעות סטטי איברים תרבות

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

In Vitro Colony Assays for Characterizing Tri-potent Progenitor Cells Isolated from the Adult Murine Pancreas

מבחני מושבת Vitro לאפיון ובתאי Tri-עצמה מבודדת מלבלב Murine למבוגרים

Stem and progenitor cells from the adult pancreas could be a potential source of therapeutic beta-like cells for treating patients with type 1 diabetes. ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

חי Confocal הדמיה של פיתוח פרחים ארבידופסיס

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development

שיטת הרכבה צדדית עבור Long Term הדמיה של פיתוח דג זברה

Zebrafish embryos offer an ideal experimental system to study complex morphogenetic processes due to their ease of accessibility and optical transparency. ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

רומן חדש פאט שומן טכניקת השתלת לדמיין את כלי השיט הדור של כלי הדם בתאי גזע אנדותל

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

כולה-הר ניקוי, כתמים של תודרנית פרח איברים, Siliques

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

ויזואליזציה של Sulcus עינית הממונה במהלך מופרה רזבורה rerio

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

ניתוח התפתחות קאמרית הלב במהלך מופרה העכבר באמצעות כל הר Epifluorescence

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...