Name: imaging the root hair morphology of arabidopsis seedlings in a two-layer microfluidic platform
Uploaded: 2017-08-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform at JoVE.com

Ce manuscrit a été écrit par UT-Battelle, LLC sous le contrat no. DE-AC05-00OR22725 avec l’US Department of Energy. Le gouvernement des Etats-Unis maintient et le serveur de publication, par l’acceptation de l’article pour publication, reconnaît que le gouvernement des États-Unis conserve une licence non exclusive, versée, irrévocable, mondial pour publier ou reproduire le formulaire publié de Ce manuscrit, ou permettre aux autres de le faire, aux fins du gouvernement des États-Unis. Le Department of Energy fournira l’accès du public à ces résultats de recherche parrainé par le gouvernement fédéral conformément au Plan de l’accès Public DOE (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Ce travail a été soutenu en partie par le programme de sciences génomiques, U.S. Department of Energy, Office of Science, biologique et recherche sur l’environnement, dans le cadre de la plante Microbe Interfaces scientifique Focus Area (http://pmi.ornl.gov). La fabrication des plateformes microfluidiques a été réalisée dans le laboratoire de recherche de Nanofabrication au Centre pour les Sciences des matériaux Nanophase, qui est un bureau d’installations de la Science utilisateurs DOE. JAA est soutenu par une bourse d’études supérieures de NSF DGE-1452154

1. deux-couche Fabrication de plate-forme
<ol>
	<li>Fabrication des maîtres multicouches
	<ol>
		<li>Spin manteau à base d’époxy de résine photosensible négative (~63.45% solides, 1 250 cSt) selon les spécifications du fabricant (2 000 tr/min 45 s) sur une plaquette de silicium de diamètre de 4 pouces pour obtenir la hauteur souhaitée de 20 µm pour la première couche de conception.</li>
		<li>Soft-cuire les gaufres resist couché pendant 4 min à 95 ° C. Permettre la plaquette refroidir po...

<ol>
	<li>Pritchard, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soil+organisms+and+global+climate+change.">Soil organisms and global climate change.</a> Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).</li><li>Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O'Neill, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-root+production+dominates+response+of+a+deciduous+forest+to+atmospheric+CO2+enrichment.">Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment.</a> Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).</li><li>McCormack, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+fine+roots+improves+understanding+of+below-ground+contributions+to+terrestrial+biosphere+processes.">Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes.</a> New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).</li><li>Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+regulation+of+polar-growth+in+plant+cells.">ROS regulation of polar-growth in plant cells.</a> Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).</li><li>Ketelaar, T., Emons, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Actin+Cytoskeleton+in+Root+Hairs:+A+Cell+Elongation+Device.">The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device.</a> Root Hairs. , 211-232 (2009).</li><li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+an+integrated+microfluidic+chip+for+plant+science.">The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science.</a> Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).</li><li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+fluorescence+imaging+of+Arabidopsis+root+growth+with+rapid+manipulation+of+the+root+environment+using+the+RootChip.">Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip.</a> J. Vis. Exp. (65), (2012).</li><li>Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+chip+for+high-throughput+phenotyping+of+Arabidopsis.">Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis.</a> Lab Chip. 14 (7), 1281 (2014).</li><li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression.">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nat. Methods. 9 (11), (2012).</li><li>Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Stimulation+of+the+Arabidopsis+thaliana+Root+using+Multi-Laminar+Flow+on+a+Microfluidic+Chip.">Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip.</a> Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).</li><li>Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+characterization+method+of+plant+root+adaptability+to+soil+environments.">Early characterization method of plant root adaptability to soil environments.</a> Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).</li><li>Sanati Nezhad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+platforms+for+plant+cells+studies.">Microfluidic platforms for plant cells studies.</a> Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).</li><li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-in-chip:+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis.">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).</li><li>Rigas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+gravitropism+and+root+hair+development+constitute+coupled+developmental+responses+regulated+by+auxin+homeostasis+in+the+Arabidopsis+root+apex.">Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex.</a> New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).</li><li>Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+elongation,+water+stress,+and+mechanical+impedance:+A+review+of+limiting+stresses+and+beneficial+root+tip+traits.">Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits.</a> J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).</li><li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+fabricated+in+poly(dimethylsiloxane)+for+biological+studies.">Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li><li>Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+culturing+primary+mammalian+neurons+at+low+densities.">Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities.</a> Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).</li><li>Nelson, B. K., Cai, X., Nebenf&#252;hr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants.">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).</li><li>Talbot, M. J., White, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+and+cell+outline+imaging+in+plant+tissues+using+the+backscattered+electron+detector+in+a+variable+pressure+scanning+electron+microscope.">Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope.</a> Plant Methods. 9 (1), 40 (2013).</li></ol>

La méthode décrite dans cet article pour la création d’une plate-forme centrale-on-a-chip est unique car les deux couches design confins les poils absorbants pour un seul plan d’imagerie et de la plate-forme peut être déconstruits et utilisés comme substrat pour l’imagerie non optiques de haute résolution . Imagerie non optiques à haute résolution peut fournir des informations précieuses sur le tissu de la plante qui ne peut pas être obtenu de l’imagerie optique seul. Par exemple, l’imagerie AFM peut...

Caractéristiques de radicelles augmentent l’eau et l’acquisition de nutriments pour la plante, explorer de nouveaux espaces de sol et d’accroître la superficie totale des racines. Le chiffre d’affaires de ces fonctionnalités de radicelles joue un rôle important dans la stimulation de l' underground chaîne alimentaire1 et le nombre de racines fines dans certaines espèces de plantes est devrait doubler en dioxyde de carbone atmosphérique élevé2. Les radicelles sont généralement définis comme ceux inférieurs à 2 mm de diamètre, bien que les nouvelles définitions préconisent pour caractériser les racines fines par leur fonction3. Comme beaucoup de fines racines, radicelles offrent les fonctions d’absorption et d’absorption mais occupent un espace beaucoup plus petit avec des diamètres de l’ordre du micron. En raison de leur petite taille, poils absorbants sont difficiles à image in situ et sont souvent négligés dans le cadre de l’architecture globale de la racine dans les modèles et les expériences en champ.
Ex terra poil étudie, tel à partir de plants cultivés sur milieu gélosé, ont présenté à la communauté scientifique des renseignements précieux sur la croissance cellulaire et de transport4,5. Tandis que les boîtes de gélose permettent des systèmes racinaires à être photographiée en temps réel et de façon non destructive, ils ne proposent pas de contrôle de l’environnement élevé pour l’ajout de traitements expérimentaux tels que les éléments nutritifs, hormones de plantes ou de bactéries. Une nouvelle solution pour faciliter l’imagerie haute résolution tout en offrant également contrôle dynamique de l’environnement a été l’avènement de plateformes microfluidiques pour les études de l’usine. Ces plates-formes ont permis la croissance non destructif et la visualisation de plusieurs espèces de plantes à haut rendement phénotypage6,7,8,9, traitements chimiques isolés 10, force dimensions11,12et l’ajout de micro-organismes13. Conceptions de plate-forme microfluidiques ont mis l’accent sur l’utilisation de couches fluidique unique espace ouvert dans lequel les racines peuvent se propager, autorisant les poils de la racine à la dérive dans et hors de l’optique mise au point au cours de la croissance ou le traitement.
Nous présentons ici une procédure pour l’élaboration d’une plateforme de microfluidique de deux couches à l’aide de photo et les méthodes douces-lithographie qui s’appuie sur les conceptions précédentes de plante-on-a-chip en limitant les poils absorbants des semis pour le plan d’imagerie de la racine principale. Cela nous permet de suivre le développement de poils absorbants en temps réel, à haute résolution et tout au long du processus de traitement expérimental. Nos méthodes de culture permettent des semis d’Arabidopsis thaliana à être mises à germer des graines au sein de la plate-forme et d’élevage pour une semaine en milieu hydraté et stérile qui ne nécessite pas l’utilisation d’équipements de pompe seringue. Après que l’expérience d’imagerie Time-lapse a conclu, la plateforme présentée ici peut être ouverte sans déranger la position des caractéristiques plus fines racines. Ceci permet l’utilisation d’autres méthodes d’imagerie haute résolution. Nous fournissons ici résultats représentatifs pour la quantification et la visualisation de la morphologie des poils absorbants dans cette plate-forme par microscopie optique, balayage (SEM) et à force atomique techniques de microscopie (AFM).

<table width="810">
	<tbody>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="width:209px;height:72px;">Silicon Wafer</td>
			<td style="width:191px;">WRS Materials</td>
			<td style="width:283px;">100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos&#60;100&#62;</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="width:209px;height:32px;">Quintel Contact Aligner</td>
			<td style="width:191px;">Neutronix Quintel Corp</td>
			<td style="width:283px;">NXQ 7500 Mask Aligner</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="width:209px;height:32px;">Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:191px;">Nikon</td>
			<td style="width:283px;">Eclipse Ti-U</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="width:209px;height:30px;">laboratory tissue</td>
			<td style="width:191px;">Kimberly Clark</td>
			<td>Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Negative Photoresist Epoxy</td>
			<td style="width:191px;">Microchem</td>
			<td style="width:283px;">SU-8 2000s series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Photoresist developer</td>
			<td style="width:191px;">Microchem</td>
			<td style="width:283px;">Su-8 developer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:209px;height:42px;">trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane</td>
			<td style="width:191px;">Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>use in chemical hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Air Plasma Cleaner</td>
			<td style="width:191px;">Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">PDMS</td>
			<td style="width:191px;">Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184 Silicone elastomer base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">PDMS curing agent</td>
			<td style="width:191px;">Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Dessicator</td>
			<td style="width:191px;">Bel-Art</td>
			<td>F42010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Scalpel</td>
			<td style="width:191px;">X-acto knife</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Biopsy Punch</td>
			<td style="width:191px;">Ted Pella</td>
			<td>15110-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Adhesive tape</td>
			<td style="width:191px;">Staples</td>
			<td>Invisible Tape</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Microfuge tube</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Triton X</td>
			<td style="width:191px;">J.T.Baker XI98-07</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Bleach</td>
			<td style="width:191px;">Chlorox</td>
			<td>concentrated</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:209px;height:42px;">Plant-Based Media</td>
			<td style="width:191px;">Phyto Technology Laboratories</td>
			<td>M524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Agar</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td>A7777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Wax film</td>
			<td style="width:191px;">Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">microscope</td>
			<td style="width:191px;">Olympus</td>
			<td>IX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:191px;">Keysight Technologies</td>
			<td>5500 PicoPlus AFM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Petri dish</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>7400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:209px;height:42px;">Dual Gun Electron Beam Evaporator</td>
			<td>Thermionics</td>
			<td>Custom Dual Electron Gun Evaporation System</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging the root hair morphology of arabidopsis seedlings in a two-layer microfluidic platform

Poils absorbants augmentent la surface racinaire pour une meilleure absorption de l’eau et l’absorption des nutriments par la plante. Parce qu’ils sont de petite taille et souvent masquée par leur environnement naturel, fonction et morphologie des poils absorbants sont difficiles à étudier et souvent exclus de la recherche sur les plantes. Ces dernières années, les plateformes microfluidiques ont offert un moyen de visualiser le système racinaire à haute résolution sans déranger les racines lors du transfert d’un système d’imagerie. La plate-forme microfluidique présentée ici s’appuie sur des recherches antérieures de plante-on-a-chip en incorporant un dispositif deux couches pour confiner la racine principale de l’Arabidopsis thaliana au même plan optique comme les poils absorbants. Cette conception permet la quantification des poils absorbants sur un téléphone cellulaire et organelle niveau et également empêche l’axe z à la dérive lors de l’ajout de traitements expérimentaux. Nous décrivons comment stocker les appareils dans une ambiance confinée et hydratée, sans la nécessité pour les pompes fluidiques, tout en maintenant un environnement gnotobiotiques pour le semis. Après l’expérience d’imagerie optique, l’appareil peut être démonté et utilisé comme substrat pour la force atomique ou la microscopie électronique à balayage tout en gardant les structures fines racines intactes.

La microfluidique PDMS diploblastique décrits ici ont un canal élevé de 200 µm pour la racine principale d’Arabidopsis et une chambre haute de 20 µm à confiner latéralement de plus en plus les poils (Figure 1 a). Cette conception peut être utilisée pour les espèces de plantes avec un diamètre racine semblable comme Arabidopsis thaliana et peut être facilement modifiée pour tenir compte des espèces de différentes tailles....

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Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

La morphologie de poils absorbants d’Arabidopsis semis dans une bicouche Microfluidic plateforme d’imagerie

Cet article montre comment la culture de semis de Arabidopsis thaliana en une plate-forme microfluidique de deux couches qui confine la racine principale et les poils absorbants pour un seul plan optique. Cette plate-forme peut être utilisée pour l’imagerie optique en temps réel de la morphologie de racines fines aussi bien en ce qui concerne l’imagerie haute résolution par d’autres moyens.

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

À haut débit Générateur expression des protéines utilisant une plate-forme microfluidique

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Recherche

Bio-ingénierie

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip

Time-lapse d&#39;imagerie par fluorescence de la croissance racinaire d&#39;Arabidopsis avec la manipulation rapide de l&#39;environnement root en utilisant le RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

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Presser cellule comme, microfluidique Delivery Platform intracellulaire robuste

Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

Microfluidic Platform for Measuring Neutrophil Chemotaxis from Unprocessed Whole Blood

Plate-forme microfluidique pour mesurer la chimiotaxie des neutrophiles du sang entier non transformé

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