Name: imaging the root hair morphology of arabidopsis seedlings in a two-layer microfluidic platform
Uploaded: 2017-08-15T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform at JoVE.com

Este manuscrito ha sido publicado por UT-Battelle, LLC bajo contrato no. DE-AC05-00OR22725 con el Departamento de energía de Estados Unidos. El gobierno de Estados Unidos retiene y el editor, al aceptar el artículo para su publicación, reconoce que el gobierno de Estados Unidos mantiene una licencia no exclusiva, liberada, irrevocable, mundial para publicar o reproducir el formulario publicado de este manuscrito, o permitir que otros lo hagan, para los propósitos del gobierno de Estados Unidos. El Departamento de energía dará acceso público a estos resultados de la investigación patrocinada por el gobierno federal según el Plan de acceso público DOE (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).
Este trabajo fue apoyado en parte por el programa de Ciencias Genómicas, Departamento de energía de Estados Unidos, oficina de ciencia, biológicas y la investigación ambiental, como parte de la planta de microbio Interfaces científicas área de enfoque (http://pmi.ornl.gov). La fabricación de las plataformas de microfluidos se llevó a cabo en el laboratorio de investigación de nanofabricación en el centro de Ciencias de materiales Nanophase, que es un DOE de ciencia usuario oficina. JAA es apoyado por una beca de investigación NSF DGE-1452154

1. dos capas fabricación de plataforma
<ol>
	<li>Fabricación de múltiples maestros
	<ol>
		<li>Vuelta capa de photoresist negativo basado en epoxy (~63.45% sólidos, 1.250 cSt) según las especificaciones del fabricante (2.000 rpm durante 45 s) sobre una oblea de silicio de 4 pulgadas de diámetro para obtener la altura deseada de 20 μm para la primera capa de diseño.</li>
		<li>Suave-cueza al horno las obleas recubierta resisten durante 4 min a 95 ° C. Permiten oblea enfriar durante 5 minutos ex...

<ol>
	<li>Pritchard, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soil+organisms+and+global+climate+change.">Soil organisms and global climate change.</a> Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).</li><li>Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O'Neill, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fine-root+production+dominates+response+of+a+deciduous+forest+to+atmospheric+CO2+enrichment.">Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment.</a> Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).</li><li>McCormack, M. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Actin+Cytoskeleton+in+Root+Hairs:+A+Cell+Elongation+Device.">The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device.</a> Root Hairs. , 211-232 (2009).</li><li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RootChip:+an+integrated+microfluidic+chip+for+plant+science.">The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science.</a> Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).</li><li>Grossmann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+fluorescence+imaging+of+Arabidopsis+root+growth+with+rapid+manipulation+of+the+root+environment+using+the+RootChip.">Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip.</a> J. Vis. Exp. (65), (2012).</li><li>Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+chip+for+high-throughput+phenotyping+of+Arabidopsis.">Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis.</a> Lab Chip. 14 (7), 1281 (2014).</li><li>Busch, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+device+and+computational+platform+for+high-throughput+live+imaging+of+gene+expression.">A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression.</a> Nat. Methods. 9 (11), (2012).</li><li>Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Stimulation+of+the+Arabidopsis+thaliana+Root+using+Multi-Laminar+Flow+on+a+Microfluidic+Chip.">Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip.</a> Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).</li><li>Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+characterization+method+of+plant+root+adaptability+to+soil+environments.">Early characterization method of plant root adaptability to soil environments.</a> Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).</li><li>Sanati Nezhad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+platforms+for+plant+cells+studies.">Microfluidic platforms for plant cells studies.</a> Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).</li><li>Parashar, A., Pandey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-in-chip:+Microfluidic+system+for+studying+root+growth+and+pathogenic+interactions+in+Arabidopsis.">Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis.</a> App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).</li><li>Rigas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+gravitropism+and+root+hair+development+constitute+coupled+developmental+responses+regulated+by+auxin+homeostasis+in+the+Arabidopsis+root+apex.">Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex.</a> New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).</li><li>Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Root+elongation,+water+stress,+and+mechanical+impedance:+A+review+of+limiting+stresses+and+beneficial+root+tip+traits.">Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits.</a> J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).</li><li>Sia, S. K., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+fabricated+in+poly(dimethylsiloxane)+for+biological+studies.">Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies.</a> Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).</li><li>Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+culturing+primary+mammalian+neurons+at+low+densities.">Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities.</a> Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).</li><li>Nelson, B. K., Cai, X., Nebenf&#252;hr, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolored+set+of+in+vivo+organelle+markers+for+co-localization+studies+in+Arabidopsis+and+other+plants.">A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants.</a> Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).</li><li>Talbot, M. J., White, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+surface+and+cell+outline+imaging+in+plant+tissues+using+the+backscattered+electron+detector+in+a+variable+pressure+scanning+electron+microscope.">Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope.</a> Plant Methods. 9 (1), 40 (2013).</li></ol>

El método descrito en este artículo para crear una plataforma de planta-en-un-chip es único en que las dos capas diseño confines los pelos de la raíz a un solo plano de proyección de imagen y la plataforma puede deconstruyen y utilizados como sustrato para la proyección de imagen de alta resolución no ópticos . Usando proyección de imagen no ópticos de alta resolución puede proporcionar información valiosa sobre el tejido de la planta que no se podía obtener de la proyección de imagen óptica sola. Por eje...

Características del bien raíz aumentan agua y adquisición de nutrientes para la planta, explorar nuevos espacios de suelo y el aumento de la superficie total de la raíz. El volumen de negocios de estas características de raíz fina juega un papel importante en estimular la cadena alimenticia metro1 y el número de raíces finas en determinadas especies de plantas es que doble en dióxido de carbono atmosférico elevado2. Raíces finas se definen generalmente como aquellos menores de 2 mm de diámetro, aunque nuevas definiciones de abogan para la caracterización de las raíces finas por su función3. Como muchas raíces finas, pelos de la raíz proporciona la función de absorción y absorción pero ocupan un espacio mucho más pequeño con un diámetro del orden de micras. Debido a su pequeño tamaño, pelos radicales son difíciles de imagen en situ y son a menudo pasados por alto como parte de la estructura general de la raíz en el campo escala experimentos y modelos.
Ex terra pelos estudios, como las plántulas cultivadas en placas de agar, han proporcionado información valiosa sobre el crecimiento celular y transporte4,5a la comunidad científica. Mientras que las placas de agar permiten sistemas de raíz a ser reflejada de forma no destructiva y en tiempo real, no ofrecen alto control ambiental por la adición de tratamientos experimentales tales como nutrientes, hormonas de plantas o bacterias. Una solución emergente para facilitar la proyección de imagen de alta resolución mientras que también ofrezcan control ambiental dinámico ha sido el advenimiento de las plataformas de microfluidos para estudios de la planta. Estas plataformas han permitido el crecimiento no destructiva y la visualización de varias especies de plantas de alto rendimiento phenotyping6,7,8,9, tratamientos químicos aislados 10, de11,de las medidas de fuerza12y la adición de microorganismos13. Diseños de plataforma de microfluidos se han centrado en el uso de capas fluídicas único espacio abierto en el que pueden propagar las raíces, permitiendo los pelos de la raíz a la deriva dentro y fuera de foco óptico durante el crecimiento o el tratamiento.
Aquí presentamos un procedimiento para desarrollar una plataforma de microfluidos dos capas utilizando métodos de litografía suave y foto que por el confinamiento de los pelos de la raíz de plántulas en el mismo plano de proyección de imagen que la raíz principal se basa en los diseños de planta-en-un-chip. Esto nos permite seguir el desarrollo de pelos radicales en tiempo real, en alta resolución y en todo el proceso de tratamiento experimental. Nuestros métodos de cultivo permiten plántulas de Arabidopsis thaliana a germinado de la semilla dentro de la plataforma y culta por hasta una semana en un ambiente estéril e hidratada que no requiere el uso de equipo de la bomba de jeringa. Una vez que ha concluido el experimento de Time-lapse, la plataforma presentada aquí puede abrirse sin perturbar la posición de las características más finas de raíz. Esto permite el uso de otros métodos de proyección de imagen de alta resolución. Aquí proporcionamos resultados representativos para la cuantificación y visualización de la morfología del pelo de la raíz en esta plataforma por microscopía óptica, exploración (SEM) y la fuerza atómica técnicas de microscopía (AFM).

<table width="810">
	<tbody>
		<tr height="72">
			<td height="72" style="width:209px;height:72px;">Silicon Wafer</td>
			<td style="width:191px;">WRS Materials</td>
			<td style="width:283px;">100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos&#60;100&#62;</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="width:209px;height:32px;">Quintel Contact Aligner</td>
			<td style="width:191px;">Neutronix Quintel Corp</td>
			<td style="width:283px;">NXQ 7500 Mask Aligner</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="width:209px;height:32px;">Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:191px;">Nikon</td>
			<td style="width:283px;">Eclipse Ti-U</td>
			<td style="width:128px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="width:209px;height:30px;">laboratory tissue</td>
			<td style="width:191px;">Kimberly Clark</td>
			<td>Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Negative Photoresist Epoxy</td>
			<td style="width:191px;">Microchem</td>
			<td style="width:283px;">SU-8 2000s series</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Photoresist developer</td>
			<td style="width:191px;">Microchem</td>
			<td style="width:283px;">Su-8 developer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:209px;height:42px;">trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane</td>
			<td style="width:191px;">Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td>use in chemical hood</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Air Plasma Cleaner</td>
			<td style="width:191px;">Harrick Plasma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">PDMS</td>
			<td style="width:191px;">Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184 Silicone elastomer base</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">PDMS curing agent</td>
			<td style="width:191px;">Dow Corning</td>
			<td>Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Dessicator</td>
			<td style="width:191px;">Bel-Art</td>
			<td>F42010-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Scalpel</td>
			<td style="width:191px;">X-acto knife</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Biopsy Punch</td>
			<td style="width:191px;">Ted Pella</td>
			<td>15110-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Adhesive tape</td>
			<td style="width:191px;">Staples</td>
			<td>Invisible Tape</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Microfuge tube</td>
			<td style="width:191px;">Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Triton X</td>
			<td style="width:191px;">J.T.Baker XI98-07</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Bleach</td>
			<td style="width:191px;">Chlorox</td>
			<td>concentrated</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:209px;height:42px;">Plant-Based Media</td>
			<td style="width:191px;">Phyto Technology Laboratories</td>
			<td>M524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Agar</td>
			<td style="width:191px;">Teknova</td>
			<td>A7777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Wax film</td>
			<td style="width:191px;">Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">microscope</td>
			<td style="width:191px;">Olympus</td>
			<td>IX51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Atomic Force Microscope</td>
			<td style="width:191px;">Keysight Technologies</td>
			<td>5500 PicoPlus AFM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Petri dish</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:209px;height:21px;">Scanning Electron Microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>7400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:209px;height:42px;">Dual Gun Electron Beam Evaporator</td>
			<td>Thermionics</td>
			<td>Custom Dual Electron Gun Evaporation System</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging the root hair morphology of arabidopsis seedlings in a two-layer microfluidic platform

Pelos de la raíz aumentar la superficie de la raíz para la mejor absorción de agua y absorción de nutrientes por la planta. Porque son de tamaño pequeño y a menudo obscured por su entorno natural, la función y morfología del pelo de la raíz son difíciles de estudiar y a menudo excluidos de la investigación de la planta. En los últimos años, las plataformas microfluídicas han ofrecido una manera de visualizar sistemas radiculares en alta resolución sin perturbar las raíces durante la transferencia a un sistema de proyección de imagen. La plataforma de microfluidos presenta aquí construye en investigaciones anteriores de la planta en un chip mediante la incorporación de un dispositivo de dos capas para limitar la raíz principal de Arabidopsis thaliana en el mismo plano óptico como los pelos de raíz. Este diseño permite la cuantificación de los pelos de la raíz en un celular y organelas nivel y también evita el eje z a la deriva durante la adición de tratamientos experimentales. Se describe cómo almacenar los dispositivos en un ambiente contenido e hidratado, sin necesidad de bombas fluídicas, manteniendo un ambiente gnotobiótico para la plántula. Tras el experimento de proyección de imagen óptico, el dispositivo puede desmontado y utilizado como sustrato de fuerza atómica o microscopía electrónica de barrido manteniendo estructuras fina raíz intacta.

Los dispositivos de microfluidos PDMS dos capas descritos aquí tienen un canal alta de 200 μm en la principal raíz de Arabidopsis y una cámara alta de 20 μm a confinar lateralmente crecientes pelos de la raíz (figura 1A). Este diseño puede usarse para especies con diámetros de raíz similares como Arabidopsis thaliana y puede ser fácilmente modificado para alojar especies de diferentes tamaños. El diseño incorpora una ent...

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Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

La morfología del pelo de la raíz de plántulas de Arabidopsis en una plataforma de microfluídica de dos capas de imagen

Este artículo muestra cómo cultivar plántulas de Arabidopsis thaliana en una plataforma de dos capas de microfluidos que confina la raíz principal y pelos de la raíz a un solo plano óptico. Esta plataforma puede utilizarse para imágenes ópticas en tiempo real de la morfología de la raíz fina, así en cuanto a la proyección de imagen de alta resolución por otros medios.

Root hairs increase root surface area for better water uptake and nutrient absorption by the plant. Because they are small in size and often obscured by ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform

High-throughput Protein Expression Generator Using a Microfluidic Platform

Proteínas de alto rendimiento del generador de expresiones utilizando una plataforma de microfluidos

Rapidly increasing fields, such as systems biology, require the development and implementation of new technologies, enabling high-throughput and ...

Investigación

Bioingeniería

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Time-lapse de imágenes de fluorescencia del crecimiento de raíces de Arabidopsis con la manipulación del ambiente rápido y raíz mediante la RootChip

The root functions as the physical anchor of the plant and is the organ responsible for uptake of water and mineral nutrients such as nitrogen, ...

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Rapid mechanical deformation of cells has emerged as a promising, vector-free method for intracellular delivery of macromolecules and nanomaterials. This ...

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Plataforma de microfluidos para la medición de quimiotaxis de neutrófilos a partir de sangre entera sin procesar

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