Name: determining cell-surface expression and endocytic rate of proteins in primary astrocyte cultures using biotinylation
Uploaded: 2017-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation at JoVE.com

Dette projekt blev støttet af det canadiske institut for sundhedsforskning PG # 20R47867.

1. Bestemmelse af relativ celleoverfladeproteinekspression i astrocytter ved biotinylering BEMÆRK: Her illustrerer vi anvendelsen af ​​denne biotinyleringsteknik til undersøgelsen af ​​virkningerne af det ekstracellulære matrixmolekyle laminin på lokalisering af celleoverfladen af ​​den vandpermeable kanal aquaporin-4 (AQP4). Specialiserede materialer, der kræves til dette assay, indbefatter sulfo-NHS-LC-biotin og streptavidin-agaroseharpiks (se tabel over materialer</...

<ol>
	<li>Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+1+inhibits+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis+and+down-regulation+in+cultured+fetal+rat+hepatocytes.">Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes.</a> J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).</li><li>Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+internalization+of+fluorescent+gonadotropin-releasing+hormone+by+pituitary+gonadotropes.">Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).</li><li>Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+uptake+and+release+by+reticulocytes+treated+with+proteolytic+enzymes+and+neuraminidase.">Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase.</a> Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).</li><li>Katsura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+and+regulated+membrane+expression+of+aquaporin+1+and+aquaporin+2+water+channels+in+stably+transfected+LLC-PK1+epithelial+cells.">Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).</li><li>Li, Y., Cam, J., Bu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+family:+endocytosis+and+signal+transduction.">Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction.</a> Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).</li><li>Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possible+identity+of+vitamin+H+with+biotin+and+coenzyme+R.">The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R.</a> Science. 91 (2358), 243-245 (1940).</li><li>Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation:+an+alternative+to+radioiodination+for+the+identification+of+cell+surface+antigens+in+immunoprecipitates.">Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates.</a> Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).</li><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+1.+the+use+of+[14-C]biotin+for+kinetic+studies+and+for+assay.">Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay.</a> Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).</li><li>Korpela, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin,+a+high+affinity+biotin-binding+protein,+as+a+tool+and+subject+of+biological+research.">Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research.</a> Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pHluorin-tagged+receptor+insertion+to+the+plasma+membrane+in+primary+cultured+mouse+neurons.">Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons.</a> J Vis Exp. (69), e4450 (2012).</li><li>Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+clathrin-mediated+endocytosis+of+G+protein-coupled+receptors+at+single-event+resolution+via+TIRF+microscopy.">Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51805 (2014).</li><li>Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+laminin-mediated+clustering+of+lipid+rafts+and+the+dystrophin+complex+in+astrocytes.">Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes.</a> J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Madrid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+trafficking+and+surface+expression+of+the+AQP4+water+channel+are+coordinated+by+serial+and+regulated+interactions+with+different+clathrin-adaptor+complexes.">Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes.</a> EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).</li><li>Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+Cell-Surface+Expression+and+Turnover+Are+Regulated+by+Dystroglycan,+Dynamin,+and+the+Extracellular+Matrix+in+Astrocytes.">Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes.</a> PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).</li></ol>

Ændringer: Da disse metoder blev designet til brug sammen med adhærente celler, har vi specificeret anvendelsen af ​​PBS indeholdende 100 mg / l MgCl2 · 6H20 og 100 mg / l CaCl2 (CM-PBS) til vaskningstrinene og som basis for visse buffere for at sikre, at cellerne forbliver fastgjort til kulturoverfladen, og at cellecelleforbindelser ikke forstyrres. Protokollerne kan dog også anvendes til ikke-adhærente celletyper, hvis cellerne pelleteres ind mellem hvert t...

Proteiner på celleoverfladen spiller en række roller, der er centrale for at opretholde cellefunktionen. I mange tilfælde er deres aktivitet afhængig af eller moduleret af endocytiske processer, som enten midlertidigt sekvestrerer dem i intracellulære steder eller leder dem til nedbrydende veje 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Her fremhæver vi 2 biotinyleringsbaserede tilgange, der er designet til at give brugeren mulighed for specifikt at tagge og isolere proteiner udtrykt ved plasmamembranen og de nyligt internaliserede. Via disse metoder kan celleoverfladeekspression og endocytisk hastighed for ethvert protein af interesse, kvantificeres, således at en klarere vurdering af dens regulering kan opnås. Bestemmelse af relativ celleoverfladeproteinekspression ved biotinylering Biotin eller vitamin B7, tidligere kendt som vitamin H6, er et lille vandopløseligt molekyle, som kan anvendes til kemisk modifikation af reaktive amin, sulfhydryl og carboxylgrupper af biologiske molekyler. Den nuværende afgrøde af biotinyleringsreagenser til celleoverflade består primært af membran-impermeant sulfonerede N-hydroxysuccinimid- (sulfo-NHS) estere af biotin eller dets derivater, der er udformet til at reagere med aminerne, der er til stede på sidekæderne af lysinrester af proteiner udtrykt i Celleoverfladen, når disse bliver deprotoneret under basiske betingelser, hvilket resulterer i, at sidstnævnte danner en amidbinding med biotindelen 7 . Således modificerede celleoverfladeproteiner kan derefter isoleres ved anvendelse af avidin, et 66-69 kDa tetramert protein, som har stor affinitet for biotin, bindende til sidstnævnte med en dissociationskonstant på ca. 10-15 , der markerer den som en af ​​de Stærkeste ikke-kovalente interaktioner kendt 8 </suP&gt; , 9 . En række alternative metoder til kvantificering af proteinekspression ved celleoverfladen er blevet anvendt i tidligere undersøgelser. Mærkningen af ​​upermeabiliserede celler, der anvender fluorescensmærket antistoffer, der er specifikke for proteinet af interesse, efterfulgt af visualisering via fluorescensmikroskopi, er for eksempel en almindeligt anvendt tilgang, men er stærkt afhængig af tilgængeligheden af ​​antistoffer, som kan binde til ekstracellulære epitoper. Mere nylig har metoder med anvendelse af kimære proteiner, der bærer pH-følsomme fluoroforer, der reagerer på at blive udsat for sure medier, også været anvendt med succes 10 . Imidlertid involverer sådanne analyser sædvanligvis den eksogene ekspression af disse konstruktioner i cellelinjer, hvori proteinet af interesse ikke er nativt fundet. Disse tilgange er dog i stand til at tilvejebringe værdifuld information vedrørende den subcellulære lokalisering og eksocytiske rejseplan forMålprotein og bør derfor anvendes sammen med de biotinyleringsbaserede fremgangsmåder, der beskrives her, hvis værktøjerne er tilgængelige. I et typisk biotinyleringsassay vaskes cellerne først grundigt i 4 ° C PBS. Dette fjerner eventuelle spor af serumproteiner introduceret af dyrkningsmediet og sikrer således, at disse ikke vil forbruge overskydende mængder biotin i det næste trin. Endnu vigtigere forårsager reduktionen i temperaturen endocytose at decelerere betydeligt. Biotinyleringsreagenset tilsættes derefter. Derefter vaskes cellerne igen og inkuberes derefter med en quenchingsbuffer indeholdende enten glycin eller NH4CI, hvis formål er at inaktivere alle resterende spor af uomsat biotin. Cellerne lyseres derefter, hvorefter agarose-immobiliseret streptavidin tilsættes for at udfælde de biotinylerede proteiner. Analyse udføres almindeligvis via western blotting, hvilket tillader den relative celleoverfladeekspression af forskellige prOteins at blive kvantificeret. På grund af grundlaget for dette assay er det kun egnet til anvendelse med proteiner, som har dele eksponeret for det ekstracellulære miljø. Multipass transmembrane proteiner, som sandsynligvis besidder et antal reaktive lysiner inden for deres sløjfeområder, er mest acceptable til denne metode, medens enkeltpasproteiner tendens til at være mindre modtagelige for at være biotinyleret. Selv i disse tilfælde forbliver der en mulighed for, at konformationsændringer eller intermolekylære interaktioner kan indekalde visse reaktive steder, hvilket resulterer i et lavere end forventet biotinyleringsudbytte. Bestemmelse af internaliseringshastigheden af ​​celleoverfladeproteiner ved biotinylering Principperne for dette assay svarer stort set til cellerne af biotinylering af celleoverfladen, med en række undtagelser, hvoraf det vigtigste er brugen af ​​reversible biotinyleringsreagenser. Biotingrupperne (af disse) har disuLfide bindinger inden for deres strukturer, der er modtagelige for reduktionsmidler; Dette udnyttes for at sikre, at kun celleoverfladeproteiner taget i intracellulære steder i assayperioden vil blive efterladt biotinyleret. Et assay finder generelt sted på følgende måde. Cellerne vaskes først og biotinyleres med kolde reagenser, hvorefter cellekulturmedium ved 37 ° C genindføres, og cellerne returneres til inkubatoren; Dette medfører, at de mærkede celleoverfladeproteiner undergår endocytose. Reduktionsmidlet glutathion - som ikke kan trænge ind i membranen - tilsættes derefter for at bryde disulfidbindingerne af biotindelene bundet til proteiner, som forbliver på celleoverfladen. Endelig omsættes de brækkede disulfidbindinger med iodacetamid, forbruges de labile thiolgrupper og forhindrer bindingerne i at reformere. Som tidligere lyseres cellerne derefter, og de mærkede proteiner udfældes under anvendelse af streptavidin-agarose. Begrænsningerne diskUssed i den foregående sektion gælder også her på grund af lighederne deles mellem metoderne. Derudover er det værd at huske på, at temperaturforskydningerne involveret i dette assay udelukker den nøjagtige bestemmelse af, hvor meget protein der endocytteres for hvert tidsforløb, især i tilfælde af hurtigt internaliserede eller hurtigt genvindingsproteiner. Assayet tilvejebringer derfor kun en semikvantant estimering af endocytiske hastigheder. Total intern refleksionsfluorescensmikroskopi kan anvendes til at spore optagelsen af ​​hver indlæst vesikel og give en mere præcis måling af kinetikken af ​​endocytose. Det kan derfor tilvejebringe et meget nyttigt komplement til dette assay, idet man antager, at en fluorescensmærket chimær konstruktion af proteinet af interesse er tilgængelig 11 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="773">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">A661-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Bromophenol blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">cOmplete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:129px;">#1610729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Iodoacetamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#163-2109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Thaw on ice.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">L-glutamine</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Mouse monoclonal anti-&#946;-actin antibody (AC-15)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Mouse monoclonal anti-&#946;-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5)</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>B-DG-CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:219px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:219px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Reduced glutathione</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>862010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Streptavidin agarose resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody</td>
			<td>Alomone</td>
			<td>AQP-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Tris base (Trizma base)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining cell-surface expression and endocytic rate of proteins in primary astrocyte cultures using biotinylation

Cell-overfladeproteiner medierer en bred vifte af funktioner. I mange tilfælde reguleres deres aktivitet ved hjælp af endocytiske processer, der modulerer deres niveauer ved plasmamembranen. Her præsenterer vi detaljerede protokoller for 2 metoder, der letter undersøgelsen af ​​sådanne processer, som begge er baseret på biotinylering af celleoverfladeproteiner. Den første er designet til at tillade den semikvantitative bestemmelse af de relative niveauer af et bestemt protein ved celleoverfladen. Heri mærkes lysinresterne af plasmamembranproteinerne fra celler først med en biotindel. Når cellerne lyseres, kan disse proteiner derefter præcipiteres ved anvendelse af agarose-immobiliseret streptavidin ved at udnytte den naturlige affinitet af sidstnævnte til biotin. Proteinerne isoleret på en sådan måde kan derefter analyseres via en standard western blotting tilgang. Den anden fremgangsmåde tilvejebringer et middel til at bestemme den endocytiske hastighed af et partikelAr celleoverflade mål over en periode. Celleoverfladeproteiner modificeres først med et biotinderivat indeholdende en spaltbar disulfidbinding. Cellerne forskydes derefter tilbage til normale dyrkningsbetingelser, hvilket forårsager den endocytiske optagelse af en andel af biotinylerede proteiner. Dernæst reduceres disulfidbindingerne af ikke-internaliserede biotingrupper under anvendelse af det membran-impermeable reduktionsmiddel glutathion. Via denne fremgangsmåde kan endocyterede proteiner således isoleres og kvantificeres med en høj grad af specificitet.

Anvendelse af celleoverfladebiotinylering til vurdering af plasmamembranekspression af AQP4 i astrocytter Lamininbehandlede astrocytkulturer og ubehandlede kontrolceller blev underkastet celleoverfladebiotinylering under anvendelse af de beskrevne fremgangsmåder. Biotinylerede proteiner blev udfældet med agarosekonjugeret streptavidin og derefter separeret via SDS-PAGE. Celleoverfladefraktioner blev probet for AQP4 og β-dystroglycan (β-DG) som en celleoverflad...

Watch this Scientific Journal Video about Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation at JoVE.com

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

To biotinyleringsbaserede metoder, der er designet til bestemmelse af celleoverfladeekspression og endocytisk hastighed af proteiner udtrykt i plasmamembranen, er præsenteret i denne rapport.

Bestemmelse af celleoverfladeekspression og endocytisk proteinhastighed i primære astrocytkulturer ved anvendelse af biotinylering

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Post-embedding immunogold mærkning af synaptiske proteiner i hippokampalskivekulturer

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Differential Mærkning af Celle-overflade og internaliseres Proteiner efter Antibody Fodring Live dyrkede neuroner

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylering: En<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Tilgang til Measure Region-specifikke plasmamembranprotein Trafficking in Adult neuroner

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

Rapid Genotypebestemmelse af dyr Efterfulgt af Etablering primære kulturer af hjerneneuroner

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

En enkel og billig metode til bestemmelse Kolde Følsomhed og tilpasning i mus

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Vurdering Primær Neurogenese i<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryoner Brug Immunfarvning

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

Pålidelig Identifikation af Living dopaminerge neuroner i midthjernen Cultures Brug RNA Sequencing og TH-promotor-drevet eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

En roman In Vitro Live-imaging analyse af Astrocyte-medieret fagocytose bruger pH indikator-konjugeret Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Målrettet udtryk af Optogenetic proteiner ved hjælp af silke/AAV film

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Identifikation af celleoverflade markører for primær neurale stamme og stamceller ved metabolisk mærkning af Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...