Name: determining cell-surface expression and endocytic rate of proteins in primary astrocyte cultures using biotinylation
Uploaded: 2017-07-03T15:00:00
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Dieses Projekt wurde vom kanadischen Institut für Gesundheitsforschung PG # 20R47867 unterstützt.

1. Bestimmung der relativen Zelloberflächen-Protein-Expression in Astrozyten durch Biotinylierung HINWEIS: Hier veranschaulichen wir die Anwendung dieser Biotinylierungstechnik auf die Untersuchung der Effekte des extrazellulären Matrixmoleküls Laminin auf die Zelloberflächenlokalisierung des wasserdurchlässigen Kanals aapaporin-4 (AQP4). Spezielle Materialien, die für diesen Assay erforderlich sind, umfassen Sulfo-NHS-LC-Biotin und Streptavidin-Agarose-Harz (siehe Tabelle der Ma...

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	<li>Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+1+inhibits+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis+and+down-regulation+in+cultured+fetal+rat+hepatocytes.">Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes.</a> J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).</li><li>Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. 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B., Burk, D., Du Vigneaud, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possible+identity+of+vitamin+H+with+biotin+and+coenzyme+R.">The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R.</a> Science. 91 (2358), 243-245 (1940).</li><li>Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation:+an+alternative+to+radioiodination+for+the+identification+of+cell+surface+antigens+in+immunoprecipitates.">Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates.</a> Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).</li><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+1.+the+use+of+[14-C]biotin+for+kinetic+studies+and+for+assay.">Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay.</a> Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).</li><li>Korpela, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin,+a+high+affinity+biotin-binding+protein,+as+a+tool+and+subject+of+biological+research.">Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research.</a> Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pHluorin-tagged+receptor+insertion+to+the+plasma+membrane+in+primary+cultured+mouse+neurons.">Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons.</a> J Vis Exp. (69), e4450 (2012).</li><li>Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+clathrin-mediated+endocytosis+of+G+protein-coupled+receptors+at+single-event+resolution+via+TIRF+microscopy.">Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51805 (2014).</li><li>Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+laminin-mediated+clustering+of+lipid+rafts+and+the+dystrophin+complex+in+astrocytes.">Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes.</a> J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Madrid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+trafficking+and+surface+expression+of+the+AQP4+water+channel+are+coordinated+by+serial+and+regulated+interactions+with+different+clathrin-adaptor+complexes.">Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes.</a> EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).</li><li>Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+Cell-Surface+Expression+and+Turnover+Are+Regulated+by+Dystroglycan,+Dynamin,+and+the+Extracellular+Matrix+in+Astrocytes.">Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes.</a> PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).</li></ol>

Änderungen: Da diese Verfahren für die Verwendung mit adhärenten Zellen entworfen wurden, haben wir die Verwendung von PBS mit 100 mg / l MgCl 2 ∙ 6H 2 O und angegeben 100 mg / l CaCl 2 (CM-PBS) für die Waschschritte und als Basis von bestimmten Puffern, um sicherzustellen, dass die Zellen an der Kulturoberfläche gebunden bleiben und dass Zell-Zell-Übergänge nicht unterbrochen werden. Jedoch können die Protokolle auch auf nic...

Proteine ​​an der Zelloberfläche spielen eine Vielzahl von Rollen, die zentral für die Aufrechterhaltung der Zellfunktion sind. In zahlreichen Fällen ist ihre Aktivität von endozytischen Prozessen abhängig oder moduliert, die sie entweder vorübergehend in intrazellulären Stellen sequestrieren oder sie auf abgebrochene Wege 1 , 2 , 3 , 4 , 5 richten. Hier heben wir 2 Biotinylierungs-basierte Ansätze hervor, die es dem Anwender ermöglichen, die an der Plasmamembran ausgedrückten Proteine ​​spezifisch zu markieren und zu isolieren, und diejenigen, die neu verinnerlicht sind. Über diese Methoden kann die Zelloberflächenexpression und die endozytische Rate eines beliebigen Proteins von Interesse quantifiziert werden, so dass eine klarere Beurteilung seiner Regulation erreicht werden kann. Bestimmung der relativen Zelloberflächen-Proteinexpression durch Biotinylierung Biotin oder Vitamin B7, früher bekannt als Vitamin H 6 , ist ein kleines wasserlösliches Molekül, das zur chemischen Modifizierung von reaktiven Amin-, Sulfhydryl- und Carboxylgruppen biologischer Moleküle verwendet werden kann. Die gegenwärtige Ernte von Zelloberflächen-Biotinylierungsreagenzien besteht hauptsächlich aus membranimpermenden sulfonierten N-Hydroxysuccinimid (Sulfo-NHS) -estern von Biotin oder seinen Derivaten, die so konstruiert sind, dass sie mit den Aminen reagieren, die an den Seitenketten von Lysinresten von Proteinen, die in Die Zelloberfläche, wenn diese unter basischen Bedingungen deprotoniert werden, was dazu führt, dass letztere eine Amidbindung mit dem Biotinrest 7 bildet . So können modifizierte, Zelloberflächenproteine ​​dann über die Verwendung von Avidin, einem 66 - 69 kDa tetrameren Protein, das eine große Affinität für Biotin besitzt, isoliert werden, wobei die Bindung an diese mit einer Dissoziationskonstante von etwa 10 &amp; supmin; &amp; sup5; &amp; supmin; &amp; sup5; Stärkste nichtkovalente Wechselwirkungen bekannt 8 </suP&gt; , 9 Eine Reihe von alternativen Verfahren zur Quantifizierung der Proteinexpression an der Zelloberfläche wurden in früheren Studien verwendet. Die Etikettierung von nichtpermeabilisierten Zellen unter Verwendung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern, die für das interessierende Protein spezifisch sind, gefolgt von der Visualisierung über Fluoreszenzmikroskopie, ist zum Beispiel ein allgemein angewandter Ansatz, ist aber stark abhängig von der Verfügbarkeit von Antikörpern, die an extrazelluläre Epitope binden können. In jüngerer Zeit wurden auch Verfahren, die die Verwendung von chimären Proteinen mit pH-empfindlichen Fluorophoren einschließen, die auf saures Medium ausgesetzt sind, erfolgreich eingesetzt worden 10 . Jedoch beinhalten solche Assays gewöhnlich die exogene Expression dieser Konstrukte in Zelllinien, in denen das Protein von Interesse nicht nativ gefunden wird. Diese Ansätze sind dennoch in der Lage, wertvolle Informationen über die subzelluläre Lokalisierung und exozytische Route derZiel-Protein und sollte daher in Verbindung mit den hier beschriebenen biotinylierungsbasierten Ansätzen verwendet werden, wenn die Werkzeuge verfügbar sind. In einem typischen Biotinylierungsassay werden die Zellen zunächst gründlich in 4 ° C PBS gewaschen. Dadurch werden Spuren von Serumproteinen, die durch das Kulturmedium eingeführt werden, entfernt, wodurch sichergestellt wird, dass diese im nächsten Schritt keine überschüssigen Mengen an Biotin verbrauchen werden. Noch wichtiger ist, dass die Verringerung der Temperatur die Endozytose deutlich verlangsamt. Das Biotinylierungsreagenz wird dann zugegeben. Als nächstes werden die Zellen wieder gewaschen und dann mit einem Quenchpuffer, der entweder Glycin oder NH &amp; sub4; Cl enthält, inkubiert, wobei der Zweck darin besteht, alle verbleibenden Spuren von nicht umgesetztem Biotin zu inaktivieren. Die Zellen werden dann lysiert, wonach Agarose-immobilisiertes Streptavidin zugegeben wird, um die biotinylierten Proteine ​​auszufällen. Die Analyse wird üblicherweise über Western-Blotting durchgeführt, was die relative Zelloberflächen-Expression verschiedener pr ermöglichtOteins zu quantifizieren. Aufgrund der Basis dieses Assays eignet es sich nur für die Verwendung von Proteinen, die Teile aufweisen, die der extrazellulären Umgebung ausgesetzt sind. Multipass-Transmembranproteine, die wahrscheinlich eine Anzahl reaktiver Lysine innerhalb ihrer Schleifenregionen besitzen, sind für diese Methode am geeignetsten, während Single-Pass-Proteine ​​dazu neigen, weniger anfällig für biotinyliert zu sein. Auch in diesen Fällen besteht die Möglichkeit, dass Konformationsänderungen oder intermolekulare Wechselwirkungen bestimmte reaktive Stellen verschließen können, was zu einer niedrigeren als erwarteten Biotinylierungsausbeute führt. Bestimmung der Internalisierungsrate von Zelloberflächenproteinen durch Biotinylierung Die Prinzipien dieses Assays ähneln weitgehend denen der Zelloberflächen-Biotinylierung mit einer Anzahl von Ausnahmen, wobei die wichtigste davon die Verwendung von reversiblen Biotinylierungsreagenzien ist. Die Biotin-Gruppen (davon) besitzen disuLfide Bindungen, in ihren Strukturen, die anfällig für Reduktionsmittel sind; Dies wird ausgenutzt, um sicherzustellen, dass nur Zelloberflächenproteine, die während der Testphase in intrazelluläre Stellen aufgenommen wurden, biotinyliert bleiben. Ein Assay findet in der Regel auf folgende Weise statt. Die Zellen werden zuerst gewaschen und mit kalten Reagenzien biotinyliert, dann wird das Zellkulturmedium bei 37 ° C wieder eingeführt und die Zellen werden in den Inkubator zurückgeführt; Dies bewirkt, dass die markierten Zelloberflächenproteine ​​einer Endozytose unterliegen. Das Reduktionsmittel Glutathion, das die Membran nicht durchdringen kann, wird dann zugegeben, um die Disulfidbindungen der Biotinreste zu brechen, die an Proteinen gebunden sind, die auf der Zelloberfläche verbleiben. Schließlich werden die gebrochenen Disulfidbindungen mit Iodacetamid umgesetzt, wobei die labilen Thiolgruppen verbraucht werden und die Bindungen daran gehindert werden, sich zu reformieren. Wie zuvor werden die Zellen dann lysiert und die markierten Proteine ​​werden unter Verwendung von Streptavidin-Agarose ausgefällt. Die BeschränkungsscheibeIm vorangegangenen Abschnitt gelten auch hier wegen der Ähnlichkeiten, die zwischen den Methoden geteilt werden. Darüber hinaus lohnt es sich zu bedenken, dass die an diesem Assay beteiligten Temperaturverschiebungen die genaue Bestimmung verhindern, wieviel Protein für jedes Zeitintervall endozytiert wird, insbesondere bei schnell verinnerlichten oder schnell recyclierenden Proteinen. Der Assay liefert daher nur eine semiquantitative Schätzung der endozytischen Raten. Total interne Reflexions-Fluoreszenzmikroskopie kann verwendet werden, um die Aufnahme jedes geladenen Vesikels zu verfolgen und eine genauere Messung der Kinetik der Endozytose zu liefern. Es kann daher eine sehr nützliche Ergänzung zu diesem Assay liefern, vorausgesetzt, dass ein fluoreszenzmarkiertes chimäres Konstrukt des Proteins von Interesse verfügbar ist 11 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="773">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">A661-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Bromophenol blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">cOmplete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:129px;">#1610729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Iodoacetamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#163-2109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Thaw on ice.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">L-glutamine</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Mouse monoclonal anti-&#946;-actin antibody (AC-15)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Mouse monoclonal anti-&#946;-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5)</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>B-DG-CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:219px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:219px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Reduced glutathione</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>862010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Streptavidin agarose resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody</td>
			<td>Alomone</td>
			<td>AQP-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Tris base (Trizma base)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining cell-surface expression and endocytic rate of proteins in primary astrocyte cultures using biotinylation

Zelloberflächenproteine ​​vermitteln eine Vielzahl von Funktionen. In vielen Fällen wird ihre Aktivität durch endozytische Prozesse reguliert, die ihre Niveaus an der Plasmamembran modulieren. Hier stellen wir detaillierte Protokolle für 2 Methoden vor, die das Studium solcher Prozesse erleichtern, die beide auf dem Prinzip der Biotinylierung von Zelloberflächenproteinen basieren. Die erste ist so konzipiert, dass sie die semi-quantitative Bestimmung der relativen Ebenen eines bestimmten Proteins an der Zelloberfläche ermöglicht. In ihr werden die Lysinreste der Plasmamembranproteine ​​der Zellen zunächst mit einer Biotineinheit markiert. Sobald die Zellen lysiert sind, können diese Proteine ​​dann spezifisch durch die Verwendung von Agarose-immobilisiertem Streptavidin ausgefällt werden, indem sie die natürliche Affinität der letzteren für Biotin ausnutzen. Die so isolierten Proteine ​​können dann über einen Standard-Western-Blotting-Ansatz analysiert werden. Die zweite Methode liefert ein Mittel zur Bestimmung der endozytischen Rate einer PartikelAr Zell-Oberfläche Ziel über einen Zeitraum von Zeit. Zelloberflächenproteine ​​werden zuerst mit einem Biotinderivat modifiziert, das eine spaltbare Disulfidbindung enthält. Die Zellen werden dann wieder auf normale Kulturbedingungen verschoben, was die endozytische Aufnahme eines Anteils an biotinylierten Proteinen bewirkt. Als nächstes werden die Disulfidbindungen von nicht internalisierten Biotin-Gruppen unter Verwendung des membranundurchlässigen Reduktionsmittels Glutathion reduziert. Über diesen Ansatz können damit endozytierte Proteine ​​mit hohem Spezifitätsgrad isoliert und quantifiziert werden.

Mit der Zelloberflächen-Biotinylierung zur Beurteilung der Plasmamembran-Expression von AQP4 in Astrozyten Laminin-behandelte Astrozytenkulturen und unbehandelte Kontrollzellen wurden unter Verwendung der beschriebenen Verfahren einer Zelloberflächen-Biotinylierung unterworfen. Biotinylierte Proteine ​​wurden mit Agarose-konjugiertem Streptavidin ausgefällt und dann über SDS-PAGE getrennt. Zelloberflächenfraktionen wurden für AQP4 und β-Dystroglycan (β...

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Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Zwei biotinylierungsbasierte Verfahren zur Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen, die an der Plasmamembran exprimiert werden, sind in diesem Bericht dargestellt.

Bestimmung der Zelloberflächenexpression und der endozytischen Rate von Proteinen in primären Astrozytenkulturen unter Verwendung von Biotinylierung

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Post-Einbettung Immunogoldmarkierung der synaptischen Proteine ​​in Hippocampusschnitt Kulturen

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Forschung

Neurowissenschaften

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Differential Markierung von Zelloberflächen und internalisierten Proteine ​​Antikörper nach Fütterung der Live-kultivierten Neuronen

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

Schnelle Genotypisierung der Tiere nach Aufbau Primärkulturen von Neuronen des Gehirns Gefolgt

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Eine einfache und kostengünstige Methode zur Bestimmung der Überempfindlichkeit auf Kälte und Anpassung an der Maus

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Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

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Die Beurteilung Primäre Neurogenese in<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryonen Immunostaining

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A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Ein neuartiges In vitro- Live-Imaging Assay Astrozyten vermittelt Phagozytose mittels pH Indikator konjugiert Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Gezielte Expression von optogenetische Proteinen mit Seide/AAV Filme

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Identifizieren von Zelloberflächenmarkern von primären neuralen Stamm- und Vorläuferzellen durch metabolische Kennzeichnung von Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...