Name: determining cell-surface expression and endocytic rate of proteins in primary astrocyte cultures using biotinylation
Uploaded: 2017-07-03T15:00:00
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Questo progetto è stato sostenuto dall&#39;Istituto canadese di ricerca sulla salute PG # 20R47867.

1. Determinazione dell&#39;espressione della proteina cellulare-superficie in astrociti mediante biotinilazione NOTA: Qui illustriamo l&#39;applicazione di questa tecnica di biotinilazione allo studio degli effetti della laminina molecolare della matrice extracellulare sulla localizzazione della superficie del canale aquaporin-4 (AQP4) permeabile all&#39;acqua. I materiali specializzati necessari per questo dosaggio comprendono la resina sulfo-NHS-LC-biotina e la streptavidina-agarosio (vedi <...

<ol>
	<li>Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+1+inhibits+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis+and+down-regulation+in+cultured+fetal+rat+hepatocytes.">Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes.</a> J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).</li><li>Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Madrid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+trafficking+and+surface+expression+of+the+AQP4+water+channel+are+coordinated+by+serial+and+regulated+interactions+with+different+clathrin-adaptor+complexes.">Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes.</a> EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).</li><li>Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+Cell-Surface+Expression+and+Turnover+Are+Regulated+by+Dystroglycan,+Dynamin,+and+the+Extracellular+Matrix+in+Astrocytes.">Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes.</a> PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).</li></ol>

modifiche: Poiché questi metodi sono stati progettati per l&#39;uso con le cellule aderenti, abbiamo specificato l&#39;uso di PBS contenente 100 mg / L di MgCl2 · 6H2O e 100 mg / L CaCl2 (CM-PBS) per i passaggi di lavaggio e come base di alcuni tamponi in modo da garantire che le cellule rimangano attaccate alla superficie di coltura e che le giunzioni delle cellule cellulari non siano interrotte. Tuttavia, i protocolli possono essere applicati anche a tipi di cellu...

Le proteine ​​alla superficie cellulare svolgono una serie di ruoli centrali per mantenere la funzione cellulare. In numerosi casi, la loro attività dipende o modulata da processi endocitici che li privano temporaneamente in siti intracellulari o che li dirigono verso percorsi degradativi 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Qui evidenziamo 2 approcci basati sulla biotinilazione progettati per consentire all&#39;utente di specificare e isolare in modo specifico le proteine ​​espresse alla membrana plasmatica e quelle recentemente internalizzate. Attraverso questi metodi, l&#39;espressione della superficie cellulare e la velocità endocitica di qualsiasi proteina di interesse possono essere quantificati, consentendo così di ottenere una più chiara valutazione della sua regolamentazione. Determinazione dell&#39;espressione proteica relativa alla superficie cellulare mediante biotinilazione La biotina o la vitamina B7, precedentemente nota come vitamina H 6 , è una piccola molecola solubile in acqua che può essere usata per modificare chimicamente gruppi amminici, sulfidrilici e carbossilici reattivi delle molecole biologiche. La coltura attuale di reagenti di biotinilazione a superficie cellulare è costituita principalmente da esteri di N-idrossisuccinimide (sulfo-NHS) solfonati a membrana, biotina o suoi derivati, progettati per reagire con le ammine presenti sulle catene laterali di residui di lisina di proteine ​​espressi La superficie cellulare quando questi diventano deprotonati in condizioni di base, con conseguente formazione di un legame amidico con la parte biotina 7 . Così modificate, le proteine ​​della superficie cellulare possono essere isolate tramite l&#39;uso di avidin, una proteina tetramerica da 66 a 69 kDa che possiede una grande affinità per la biotina, legandola a quest&#39;ultimo con una costante di dissociazione di circa 10-15 , che la contrassegna come uno dei Interazioni non-covalenti più forti conosciute 8 </suP&gt; , 9 . Alcuni metodi alternativi di quantificazione dell&#39;espressione di proteine ​​sulla superficie cellulare sono stati utilizzati negli studi precedenti. L&#39;etichettatura delle cellule non-permeabilizzate usando anticorpi fluorescenti specifici per la proteina di interesse, seguita dalla visualizzazione tramite microscopia a fluorescenza, ad esempio, è un approccio comunemente impiegato, ma è fortemente dipendente dalla disponibilità di anticorpi che possono legarsi ad epitopi extracellulari. Più recentemente sono stati impiegati anche metodi che prevedono l&#39;uso di proteine ​​chimiche contenenti fluorofori sensibili al pH che reagiscono ad essere esposti a supporti acidi. Tuttavia, tali analisi coinvolgono solitamente l&#39;espressione esogena di questi costrutti nelle linee cellulari in cui la proteina di interesse non viene trovata nativamente. Questi approcci sono comunque in grado di fornire informazioni preziose sulla localizzazione subcellulare e l&#39;itinerario esocitario delProteina bersaglio, e quindi dovrebbe essere utilizzato in combinazione con gli approcci basati sulla biotinilazione qui descritti se gli strumenti sono disponibili. In un test di biotinilazione tipico, le cellule vengono prima lavate accuratamente in PBS a 4 ° C. Ciò elimina tutte le tracce di proteine ​​del siero introdotte dal mezzo di coltura, assicurando così che queste non consumino quantità eccessive di biotina nel passo successivo. Ancora più importante, la riduzione della temperatura induce l&#39;decociazione significativa dell&#39;endocitosi. Viene quindi aggiunto il reagente di biotinazione. Successivamente, le cellule vengono nuovamente lavate e successivamente incubate con un tampone di cottura contenente sia glicina che NH 4 Cl, il cui scopo è quello di inattivare tutte le residue tracce di biotina non reagita. Le cellule vengono quindi lisate, seguendo il quale viene aggiunto streptavidina immobilizzato agarosio per precipitare le proteine ​​biotinilate. L&#39;analisi viene comunemente eseguita mediante blotting occidentale, permettendo la relativa espressione della superficie cellulare su vari prQuantitativi di otteini. A causa della base di questo test, è adatto solo per le proteine ​​che possiedono porzioni esposte all&#39;ambiente extracellulare. Le proteine ​​di transmembrana multipass, che probabilmente possiedono un certo numero di lisine reattive all&#39;interno delle loro regioni di ciclo, sono il più idoneo a questo metodo, mentre le proteine ​​a singolo passaggio tendono ad essere meno suscettibili di essere biotinilate. Anche in questi casi, resta la possibilità che le modificazioni conformazionali o le interazioni intermolecolari possano occludere determinati siti reattivi, con conseguente rendimento inferiore a quello previsto della biotinilazione. Determinare la velocità di internalizzazione delle proteine ​​della superficie cellulare mediante biotinilazione I principi di questo test sono in gran parte simili a quelli della biotinilazione a superficie cellulare, con una serie di eccezioni, il più importante dei quali è l&#39;uso di reattivi reattivi di biotinilazione. I gruppi di biotina (di questi) possiedono disuOsservi le obbligazioni, all&#39;interno delle loro strutture, suscettibili di ridurre gli agenti; Questo è sfruttato per garantire che solo le proteine ​​della superficie cellulare prese in siti intracellulari durante il periodo di dosaggio saranno lasciati biotinilati. Un dosaggio si svolge generalmente nel seguente modo. Le cellule vengono prima lavate e biotinilate con reagenti freddi, quindi viene riportato il terreno di coltura a 37 ° C e le cellule vengono riportate all&#39;incubatrice; Ciò induce le etichettate proteine ​​della superficie cellulare a subire l&#39;endocitosi. L&#39;agente riducente glutatione - che non può penetrare nella membrana - viene quindi aggiunto per rompere i legami disolfuro delle parti biotiniche attaccate a proteine ​​rimaste sulla superficie cellulare. Infine, i legami disolfuro rotti vengono reagiti con iodoacetamide, consumando i gruppi tiolici labili e impedendo i legami di riformare. Come prima, le cellule vengono poi lisate e le proteine ​​etichettate vengono precipitate usando streptavidina-agarosio. Il disco delle limitazioniUtilizzati nella sezione precedente si applicano anche qui per le somiglianze condivise tra i metodi. Inoltre, vale la pena ricordare che gli spostamenti di temperatura coinvolti in questo dosaggio precludono l&#39;esatta determinazione di quanto proteina sia endocitata per ogni incremento di tempo, in particolare nel caso di proteine ​​rapidamente internalizzate o riciclate rapidamente. Il dosaggio fornisce quindi una stima semiquantitative di tassi endocitici. La microscopia a fluorescenza completa di riflessione interna può essere usata per monitorare l&#39;assorbimento di ogni vescolina caricata e fornire una misurazione più precisa della cinetica dell&#39;endocitosi. Può quindi fornire un complemento molto utile a questo dosaggio, supponendo che sia disponibile un costrutto chimerico tagliato fluorescente della proteina di interesse 11 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="773">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">A661-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Bromophenol blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">cOmplete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:129px;">#1610729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Iodoacetamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#163-2109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Thaw on ice.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">L-glutamine</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Mouse monoclonal anti-&#946;-actin antibody (AC-15)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Mouse monoclonal anti-&#946;-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5)</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>B-DG-CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:219px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:219px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Reduced glutathione</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>862010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Streptavidin agarose resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody</td>
			<td>Alomone</td>
			<td>AQP-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Tris base (Trizma base)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining cell-surface expression and endocytic rate of proteins in primary astrocyte cultures using biotinylation

Le proteine ​​delle cellule superano una vasta gamma di funzioni. In molti casi, la loro attività è regolata da processi endocitici che modulano i loro livelli alla membrana plasmatica. Qui presentiamo protocolli dettagliati per 2 metodi che facilitano lo studio di tali processi, entrambi basati sul principio della biotinilazione delle proteine ​​della superficie cellulare. Il primo è stato progettato per consentire la determinazione semiquantitativa dei livelli relativi di una particolare proteina sulla superficie cellulare. In esso, i residui di lisina delle proteine ​​della membrana plasmatica delle cellule vengono prima etichettate con una parte di biotina. Una volta che le cellule sono lisate, queste proteine ​​possono essere specificamente precipitate mediante l&#39;uso di streptavidina immobilizzato da agarosio sfruttando l&#39;affinità naturale di quest&#39;ultimo per la biotina. Le proteine ​​isolate in tal modo possono quindi essere analizzate mediante un approccio Western blotting standard. Il secondo metodo fornisce un mezzo per determinare la velocità endocitica di un particulTarget di superficie cellulare per un periodo di tempo. Le proteine ​​della superficie cellulare vengono prima modificate con un derivato della biotina contenente un legame disolfuro schiarente. Le cellule vengono quindi spostate indietro a condizioni di coltura normali, che provocano l&#39;assunzione endocitica di una percentuale di proteine ​​biotinilate. Successivamente, i legami disolfuro di gruppi di biotina non internalizzati vengono ridotti utilizzando il glutatione impermeabile per riduzione della membrana. Attraverso questo approccio, le proteine ​​endocitose possono quindi essere isolate e quantificate con un elevato grado di specificità.

Utilizzando la biotinilazione della superficie cellulare per valutare l&#39;espressione della membrana plasmatica di AQP4 in astrociti Le colture astrocitiche trattate con Laminin e le cellule di controllo non trattate sono state soggette a biotinilazione a superficie cellulare utilizzando i metodi descritti. Le proteine ​​biotinilate sono state precipitate con streptavidina coniugata con agarosio e quindi separate mediante SDS-PAGE. Le frazioni di superficie ...

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Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Due metodi basati sulla biotinilazione, progettati per determinare l&#39;espressione della superficie cellulare e la percentuale endocitica di proteine ​​espressi alla membrana plasmatica, sono presentati in questa relazione.

Determinazione dell&#39;espressione della superficie cellulare e della velocità endocitica delle proteine ​​nelle colture primarie di astrociti usando la biotinilazione

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

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Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

Identificazione affidabile di vita neuroni dopaminergici in Culture Midbrain Utilizzando RNA Sequencing e TH-promotore-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Un romanzo In Vitro Live-imaging dosaggio del Astrocyte-mediata fagocitosi utilizzando pH indicatore-coniugato sinaptosomi

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Mirati espressione delle proteine di optogenetica utilizzando seta/AAV film

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Identificazione dei marcatori di superficie cellulare delle cellule staminali primarie e delle cellule progenitrici mediante l'etichettatura metabolica di Sialoglycan

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...

Determinazione dell'espressione della superficie cellulare e della velocità endocitica delle proteine ​​nelle colture primarie di astrociti usando la biotinilazione

Determinazione dell'espressione della superficie cellulare e della velocità endocitica delle proteine nelle colture primarie di astrociti usando la biotinilazione