Name: determining cell-surface expression and endocytic rate of proteins in primary astrocyte cultures using biotinylation
Uploaded: 2017-07-03T15:00:00
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이 프로젝트는 Canadian Institute of Health Research PG # 20R47867에 의해 지원되었습니다.

1. Biotinylation에 의한 astrocytes의 상대 세포 표면 단백질 발현 결정 참고 : 여기, 우리는 물 투과성 채널 aquaporin - 4 (AQP4)의 세포 - 표면 지방화에 세포 외 매트릭스 분자 laminin의 효과 연구에이 biotinylation 기술의 응용 프로그램을 설명합니다. 이 분석에 필요한 특수 물질에는 sulfo-NHS-LC-biotin 및 streptavidin-agarose 수지가 포함됩니다 ( 표 참조). <ol><li> Noel et al. <sup...

<ol>
	<li>Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+1+inhibits+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis+and+down-regulation+in+cultured+fetal+rat+hepatocytes.">Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes.</a> J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).</li><li>Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+internalization+of+fluorescent+gonadotropin-releasing+hormone+by+pituitary+gonadotropes.">Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).</li><li>Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+uptake+and+release+by+reticulocytes+treated+with+proteolytic+enzymes+and+neuraminidase.">Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase.</a> Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).</li><li>Katsura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+and+regulated+membrane+expression+of+aquaporin+1+and+aquaporin+2+water+channels+in+stably+transfected+LLC-PK1+epithelial+cells.">Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).</li><li>Li, Y., Cam, J., Bu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+family:+endocytosis+and+signal+transduction.">Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction.</a> Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).</li><li>Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possible+identity+of+vitamin+H+with+biotin+and+coenzyme+R.">The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R.</a> Science. 91 (2358), 243-245 (1940).</li><li>Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation:+an+alternative+to+radioiodination+for+the+identification+of+cell+surface+antigens+in+immunoprecipitates.">Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates.</a> Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).</li><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+1.+the+use+of+[14-C]biotin+for+kinetic+studies+and+for+assay.">Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay.</a> Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).</li><li>Korpela, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin,+a+high+affinity+biotin-binding+protein,+as+a+tool+and+subject+of+biological+research.">Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research.</a> Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pHluorin-tagged+receptor+insertion+to+the+plasma+membrane+in+primary+cultured+mouse+neurons.">Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons.</a> J Vis Exp. (69), e4450 (2012).</li><li>Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+clathrin-mediated+endocytosis+of+G+protein-coupled+receptors+at+single-event+resolution+via+TIRF+microscopy.">Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51805 (2014).</li><li>Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+laminin-mediated+clustering+of+lipid+rafts+and+the+dystrophin+complex+in+astrocytes.">Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes.</a> J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Madrid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+trafficking+and+surface+expression+of+the+AQP4+water+channel+are+coordinated+by+serial+and+regulated+interactions+with+different+clathrin-adaptor+complexes.">Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes.</a> EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).</li><li>Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+Cell-Surface+Expression+and+Turnover+Are+Regulated+by+Dystroglycan,+Dynamin,+and+the+Extracellular+Matrix+in+Astrocytes.">Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes.</a> PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).</li></ol>

수정 : 이 방법은 접착 세포에 사용하기 위해 고안 되었기 때문에 100 mg / L MgCl 2 · 6H 2 O를 함유 한 PBS와 100 mg / L CaCl 2 (CM-PBS)를 세척 단계 및 세포가 배양 표면에 부착 된 채로 유지되도록하고 세포 - 세포 접합부가 파괴되지 않도록하기 위해 특정 완충액의 기제로 사용한다. 그러나, 프로토콜은 절차의 각 단계 사이에 세포가 pelleted ?...

세포 표면의 단백질은 세포 기능을 유지하는 데 중심적인 역할을합니다. 수많은 경우에, 그들의 활동은 endocytic process에 의존적이거나 세포 내 부위에서 일시적으로 sequencing하는 endocytic process에 의해 조절되거나, 분해 경로 1 , 2 , 3 , 4 , 5로 향한다. 여기에서 우리는 2 개의 biotinylation 기반 접근법을 강조하여 사용자가 원형 막에서 발현 된 단백질과 새로 내부화 된 단백질을 특이 적으로 표지하고 분리 할 수 ​​있도록했습니다. 이 방법을 통해 관심있는 모든 단백질의 세포 표면 발현 및 endocytic 속도를 정량화 할 수 있으므로 해당 규정을보다 명확하게 평가할 수 있습니다. biotinylation에 의한 상대 세포 표면 단백질 발현 측정 Biotin 또는 이전에 비타민 H 6 로 알려진 비타민 B7은 생물학적 분자의 반응성 아민, 설프 하이 드릴 및 카르복시기를 화학적으로 변형시키는 데 사용할 수있는 작은 수용성 분자입니다. 세포 표면 바이오시 닐화 시약의 현재 작물은 주로 표적 단백질의 라이신 잔기의 측쇄에 존재하는 아민과 반응하도록 고안된 비오틴 또는 그 유도체의 막 - 불 투과성 술 폰화 N- 히드 록시 석신이 미드 (술포 -NHS) 에스테르로 구성된다 이들이 염기성 조건 하에서 탈 양성자 화 될 때 세포 표면은 비오틴 부분과 아미드 결합을 형성한다. 따라서 변형 된 세포 표면 단백질은 avidin, biotin에 큰 친 화성을 갖는 66 - 69 kDa의 4 량체 단백질을 사용하여 분리 될 수 있으며, 약 10 -15 의 해리 상수로 후자에 결합하여 가장 강한 비공유 상호 작용 8 </sup&gt; , 9 . 이전 연구에서 세포 표면에서 단백질 발현을 정량화하는 여러 가지 대체 방법이 사용되었습니다. 예를 들어, 형광 현미경을 통한 시각화에 이어 관심있는 단백질에 특이적인 형광 태그 항체를 사용하는 비 통과 세포의 표지는 일반적으로 사용되는 방법이지만 세포 외 에피토프에 결합 할 수있는 항체의 유용성에 크게 의존한다. 최근에, 산성 배지에 노출되는 것에 반응하는 pH 민감성 형광 단을 갖는 키메라 단백질의 사용과 관련된 방법도 성공적으로 사용되었다. 그러나, 그러한 분석은 일반적으로 관심 단백질이 본래 발견되지 않는 세포주에서 이러한 구조물의 외인성 발현을 수반한다. 그럼에도 불구하고 이러한 접근법은 세포 내 지방화 및 세포 외 경로에 관한 귀중한 정보를 제공 할 수 있습니다.그러므로 목적에 맞는 도구가 있다면 여기에 기술 된 biotinylation-based approach와 함께 사용해야한다. 전형적인 biotinylation 분석에서, 세포는 먼저 4 ° C PBS에서 철저히 씻어냅니다. 이것은 배양 배지에 의해 도입 된 혈청 단백질의 흔적을 제거하여 다음 단계에서 과량의 바이오틴을 소비하지 않도록합니다. 더 중요한 것은, 온도의 감소는 엔도 사이토 시스 (endocytosis)를 현저하게 감속시키는 것입니다. 이어서, 바이오틴 화 시약을 첨가한다. 다음으로, 세포를 다시 세척 한 다음 글리신 또는 NH4Cl을 포함하는 담금질 완충액 (quenching buffer)과 함께 배양한다.이 목적은 남아있는 미량의 바이오틴 잔여 물을 모두 비활성화시키는 것이다. 세포를 용해시킨 후, 아가로 오스 고정화 된 스트렙 타비 딘을 첨가하여 비오틴 화 단백질을 침전시킨다. 분석은 일반적으로 웨스턴 블 랏팅을 통해 수행되어 다양한 pr정량 될 oteins. 이 분석의 기초 때문에, 그것은 세포 외 환경에 노출 된 부분을 소유 한 단백질에만 사용하기에 적합합니다. 루프 영역 내에 다수의 반응성 라이신을 보유하고있을 가능성이있는 멀티 패스 트랜스 멤브레인 단백질이이 방법에 가장 적합하며 단일 통과 단백질은 비오틴 화에 덜 민감한 경향이있다. 이러한 경우에도, 구조적 변화 또는 분자간 상호 작용이 특정 반응성 부위를 폐쇄하여 예상보다 낮은 바이오틴 일 수율을 초래할 가능성이있다. biotinylation에 의한 세포 표면 단백질의 internalization 속도 결정 이 분석의 원리는 세포 표면 비 오티 닐화의 원리와 대체로 유사하며, 그 중 가장 중요한 것은 가역성 바이오 티 닐화 시약의 사용이다. Biotin 그룹 (이들 중)은 disu그 구조 내에서 환원제에 민감한 결합을 형성하는 결합; 이것은 분석 기간 동안 세포 내 단백질로만 포획 된 세포 표면 단백질 만 바이오틴 화 된 상태로 유지되도록하기 위해 이용됩니다. 분석은 일반적으로 다음과 같은 방식으로 수행됩니다. 세포를 먼저 세척하고 차가운 시약으로 바이오 티 닐화 한 다음 37 ° C에서 세포 배양 배지를 다시 넣고 배양기로 되돌립니다. 이것은 표식 된 세포 표면 단백질이 엔도 사이토 시스를 일으키는 원인이된다. 막을 통과 할 수없는 환원제 글루타티온을 첨가하여 세포 표면에 남아있는 단백질에 붙어있는 비오틴 부분의 디설파이드 결합을 깨뜨린다. 마지막으로, 파괴 된 디설파이드 결합은 요오도 아세트 아미드와 반응하여 불안정한 티올 그룹을 소비하고 결합이 개질되는 것을 방지한다. 이전과 마찬가지로 세포를 용해시키고 스트렙 타비 딘 - 아가로 오스를 사용하여 표지 단백질을 침전시킵니다. 한계 디스크이전 섹션에서 사용 된 것은 또한 메소드간에 공유되는 유사성 때문에 여기에 적용됩니다. 또한,이 분석에 포함 된 온도 변화가 시간의 각 증대에 대해 얼마나 많은 단백질이 endocytosed되는지를 정확히 결정하는 것을 방지 할 가치가 있습니다. 특히 빠르게 내부화되거나 급속히 재활용되는 단백질의 경우 더욱 그렇습니다. 따라서 분석법은 endocytic rate의 반 정량적 평가만을 제공합니다. 총 내부 반사 형광 현미경 검사는 각로드 된 소포의 섭취를 추적하고 엔도 사이토 시스의 동역학에 대한보다 정확한 측정을 제공하는 데 사용될 수 있습니다. 따라서 관심있는 단백질의 형광 표식 된 키메라 구조가 이용 가능하다고 가정하여이 분석에 매우 유용한 보완 물을 제공 할 수 있습니다 11 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="773">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">A661-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Bromophenol blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">cOmplete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:129px;">#1610729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Iodoacetamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#163-2109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Thaw on ice.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">L-glutamine</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Mouse monoclonal anti-&#946;-actin antibody (AC-15)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Mouse monoclonal anti-&#946;-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5)</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>B-DG-CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:219px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:219px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Reduced glutathione</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>862010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Streptavidin agarose resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody</td>
			<td>Alomone</td>
			<td>AQP-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Tris base (Trizma base)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining cell-surface expression and endocytic rate of proteins in primary astrocyte cultures using biotinylation

세포 표면 단백질은 다양한 기능을 매개합니다. 많은 경우에, 그들의 활동은 원형질막에서 그들의 수준을 조절하는 endocytic 과정에 의해 조절됩니다. 여기, 우리는 세포 표면 단백질의 biotinylation의 원리를 기반으로 이러한 프로세스의 연구를 용이하게 2 가지 방법에 대한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 첫 번째는 세포 표면에서 특정 단백질의 상대적인 수준의 반 정량 결정을 허용하도록 설계되었습니다. 그것의 세포막 단백질의 라이신 잔기는 먼저 바이오틴 잔기로 표지됩니다. 일단 세포가 용해되면, 이들 단백질은 바이오틴에 대한 후자의 자연 친화력을 이용하여 아가로 오스 고정화 스트렙 타비 딘의 사용을 통해 특이 적으로 침전 될 수있다. 그런 방식으로 단리 된 단백질을 표준 웨스턴 블 랏팅 접근법을 통해 분석 할 수있다. 두 번째 방법은 particul의 endocytic 속도를 결정하는 방법을 제공합니다일정 시간 동안 세포 표면 표적을 감소시킨다. 세포 표면 단백질은 절단 가능한 디설파이드 결합을 포함하는 바이오틴 유도체로 먼저 변형된다. 그런 다음 세포를 정상 배양 조건으로 다시 이동시켜 비오틴 화 단백질의 일부를 엔도 사이토 (endocytic)로 흡수시킵니다. 다음으로, 멤브레인 - 불 침투성 환원제 인 글루타티온을 사용하여 비 내부화 된 바이오틴 그룹의 디설파이드 결합을 감소시킨다. 이 접근법을 통해, endocytosed protein은 분리되어 고도의 특이성으로 정량화 될 수 있습니다.

세포 표면 biotinylation을 사용하여 성상 교세포에서 AQP4의 원형질막 발현을 평가 라미닌 - 처리 된 성상 교세포 배양 물 및 미처리 된 대조군 세포를 기술 된 방법을 사용하여 세포 - 표면 바이오틴 일화시켰다. 바이오 티 닐화 된 단백질을 아가 로즈 - 결합 된 스트렙 타비 딘으로 침전시킨 다음, SDS-PAGE로 분리 하였다. 세포 표면 분획을 AQP4와 β-Dystroglycan (β...

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Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

혈장 막에서 발현 된 단백질의 세포 표면 발현 및 endocytic 속도를 결정하기 위해 고안된 두 가지의 바이오 티 닐화 기반 방법이이 보고서에 제시되어있다.

Biotinylation을 사용하여 기본 Astrocyte 문화에서 단백질의 세포 표면 표현 및 Endocytic 속도를 결정

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Research

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Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

연구

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Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

뇌 슬라이스 바이오 티 닐화 :<em&gt; 전의 VIVO</em성인 뉴런에서 지역 고유의 플라즈마 막 단백질 인신 매매를 측정하는&gt; 접근

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

동물의 신속한 유전자형은 뇌 신경 세포의 차 문화 구축에 이어

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

마우스에 콜드 민감도 및 적응을 결정하기위한 간단하고 저렴한 방법

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

에서 차 신경 발생 평가<em&gt; Xenopus의</em&gt; 배아 사용하여 면역 염색

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

소설 체 외에 라이브 이미징 분석 결과의 사이토 중재 먹어서 사용 하 여 pH 지시자 활용 Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Vivo에서 실크/AAV 영화를 사용 하 여 Optogenetic 단백질의 표적으로 표현

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Sialoglycan의 신진 대사 표지에 의하여 1 차적인 신경 줄기 및 전구 세포의 세포 표면 마커를 확인

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...