Name: determining cell-surface expression and endocytic rate of proteins in primary astrocyte cultures using biotinylation
Uploaded: 2017-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation at JoVE.com

Этот проект был поддержан Канадским Институтом Исследования Здравоохранения PG # 20R47867.

1. Определение относительной экспрессии белка клеточной поверхности в астроцитах путем биотинилирования ПРИМЕЧАНИЕ. Здесь мы проиллюстрируем применение этой технологии биотинилирования для изучения влияния ламинана молекулы внеклеточного матрикса на локализацию кл?...

<ol>
	<li>Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+1+inhibits+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis+and+down-regulation+in+cultured+fetal+rat+hepatocytes.">Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes.</a> J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).</li><li>Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+internalization+of+fluorescent+gonadotropin-releasing+hormone+by+pituitary+gonadotropes.">Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).</li><li>Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+uptake+and+release+by+reticulocytes+treated+with+proteolytic+enzymes+and+neuraminidase.">Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase.</a> Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).</li><li>Katsura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+and+regulated+membrane+expression+of+aquaporin+1+and+aquaporin+2+water+channels+in+stably+transfected+LLC-PK1+epithelial+cells.">Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).</li><li>Li, Y., Cam, J., Bu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+family:+endocytosis+and+signal+transduction.">Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction.</a> Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).</li><li>Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possible+identity+of+vitamin+H+with+biotin+and+coenzyme+R.">The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R.</a> Science. 91 (2358), 243-245 (1940).</li><li>Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation:+an+alternative+to+radioiodination+for+the+identification+of+cell+surface+antigens+in+immunoprecipitates.">Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates.</a> Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).</li><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+1.+the+use+of+[14-C]biotin+for+kinetic+studies+and+for+assay.">Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay.</a> Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).</li><li>Korpela, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin,+a+high+affinity+biotin-binding+protein,+as+a+tool+and+subject+of+biological+research.">Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research.</a> Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pHluorin-tagged+receptor+insertion+to+the+plasma+membrane+in+primary+cultured+mouse+neurons.">Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons.</a> J Vis Exp. (69), e4450 (2012).</li><li>Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+clathrin-mediated+endocytosis+of+G+protein-coupled+receptors+at+single-event+resolution+via+TIRF+microscopy.">Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51805 (2014).</li><li>Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+laminin-mediated+clustering+of+lipid+rafts+and+the+dystrophin+complex+in+astrocytes.">Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes.</a> J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Madrid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+trafficking+and+surface+expression+of+the+AQP4+water+channel+are+coordinated+by+serial+and+regulated+interactions+with+different+clathrin-adaptor+complexes.">Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes.</a> EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).</li><li>Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+Cell-Surface+Expression+and+Turnover+Are+Regulated+by+Dystroglycan,+Dynamin,+and+the+Extracellular+Matrix+in+Astrocytes.">Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes.</a> PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).</li></ol>

Модификации: Поскольку эти методы были разработаны для использования с адгезивными клетками, мы указали использование PBS, содержащего 100 мг / л MgCl 2 ∙ 6H 2 O и 100 мг / л CaCl 2 (CM-PBS) для этапов промывки и в качестве основы некоторых буферов, чтобы гар?...

Белки на поверхности клеток играют множество ролей, центральных для поддержания функции клеток. Во многих случаях их активность зависит от или модулируется эндоцитарными процессами, которые либо временно секвестрируют их во внутриклеточных сайтах, либо направляют их на деградирующие пути 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Здесь мы выделяем два подхода на основе биотинилирования, предназначенные для того, чтобы пользователь мог специфически маркировать и изолировать белки, выраженные на плазматической мембране, и те, которые были недавно интернализованы. С помощью этих методов экспрессия клеточной поверхности и скорость эндоцитов любого представляющего интерес белка могут быть количественно определены, что позволяет получить более четкую оценку его регулирования. Определение относительной экспрессии белка клеточной поверхности путем биотинилирования Биотин или витамин B7, ранее известный как витамин H 6 , представляет собой небольшую водорастворимую молекулу, которая может быть использована для химического изменения реакционноспособных аминов, сульфгидрильных и карбоксильных групп биологических молекул. Текущая культура биотинилирующих реагентов на поверхности клеток состоит в основном из мембранно-непроницаемых сульфированных N-гидроксисукцинимидных (сульфо-NHS) эфиров биотина или его производных, предназначенных для взаимодействия с аминами, присутствующими на боковых цепях лизиновых остатков белков, выраженных в Клеточной поверхности, когда они депротонированы в основных условиях, в результате чего последний образует амидную связь с биотиновой частью 7 . Таким образом, модифицированные белки клеточной поверхности затем могут быть выделены с использованием авидина, теримерного белка 66-69 кДа, обладающего большим сродством к биотину, связывающегося с ним с константой диссоциации приблизительно 10-15 , отмечая ее как одну из Самые сильные нековалентные взаимодействия, известные 8 </suP&gt; , 9 . В предыдущих исследованиях использовался ряд альтернативных методов количественного определения экспрессии белка на поверхности клетки. Маркировка неперфинансированных клеток с использованием флуоресцентно меченных антител, специфичных для интересующего белка, с последующей визуализацией с помощью флуоресцентной микроскопии, например, является обычно используемым подходом, но в значительной степени зависит от наличия антител, которые могут связываться с внеклеточными эпитопами. Совсем недавно были успешно применены методы, связанные с использованием химерных белков, несущих рН-чувствительные флуорофоры, которые реагируют на воздействие кислых сред. 10 . Однако такие анализы обычно включают экзогенную экспрессию этих конструкций в клеточных линиях, в которых интересующий белок изначально не обнаружен. Эти подходы, тем не менее, могут предоставить ценную информацию о субклеточной локализации и экзоцитарном маршрутеЦелевого белка, и поэтому его следует использовать в сочетании с подходами на основе биотинилирования, описанными здесь, если инструменты доступны. В типичном анализе биотинилирования клетки сначала тщательно промывают в PBS при 4 ° С. Это удаляет любые следы белков сыворотки, вводимых культуральной средой, тем самым гарантируя, что они не будут потреблять избыточные количества биотина на следующем этапе. Что еще более важно, снижение температуры приводит к значительному замедлению эндоцитоза. Затем добавляют биотинилирующий реагент. Затем клетки снова промывают и затем инкубируют с закалочным буфером, содержащим либо глицин, либо NH 4 Cl, целью которого является инактивация всех оставшихся следов непрореагировавшего биотина. Затем клетки лизируют, после чего добавляют агароз-иммобилизованный стрептавидин для осаждения биотинилированных белков. Анализ обычно проводят через вестерн-блоттинг, позволяя относительную экспрессию клеточной поверхности различных пр.Катехинов, подлежащих количественному определению. Благодаря основанию этого анализа он подходит для использования только с белками, обладающими участками, подверженными воздействию внеклеточной среды. Наиболее эффективными для этого являются мультимные трансмембранные белки, которые, вероятно, обладают рядом реакционноспособных лизинов в их петлевых областях, в то время как однопроходные белки, как правило, менее восприимчивы к биотинилированию. Даже в этих случаях сохраняется вероятность того, что конформационные изменения или межмолекулярные взаимодействия могут перекрывать некоторые реакционноспособные сайты, что приводит к более низким, чем ожидалось, выходам биотинилирования. Определение скорости интернализации белков клеточной поверхности путем биотинилирования Принципы этого анализа во многом аналогичны принципам биотинилирования клеточной поверхности, за некоторыми исключениями, наиболее важным из которых является использование обратимых реагентов биотинилирования. Группы биотина (из них) обладают дисуВ пределах их структур, которые восприимчивы к восстановителям; Это используется для обеспечения того, чтобы только белки клеточной поверхности, взятые во внутриклеточные сайты в течение периода анализа, оставались биотинилированными. Анализ обычно проводится следующим образом. Клетки сначала промывают и биотинилируют с помощью холодных реагентов, затем снова добавляют среду для культивирования клеток при 37 ° С и клетки возвращают в инкубатор; Это приводит к тому, что меченые белки клеточной поверхности подвергаются эндоцитозу. Затем добавляют глутатион восстановителя, который не может проникать через мембрану, для разрыва дисульфидных связей биотиновых остатков, связанных с белками, остающимися на поверхности клетки. Наконец, сломанные дисульфидные связи реагируют с иодацетамидом, потребляя лабильные тиольные группы и препятствуя реформированию связей. Как и раньше, клетки затем лизируют, и меченые белки осаждаются с использованием стрептавидин-агарозы. Ограничение дискаИспользуемые в предыдущем разделе, также применимы здесь из-за сходства между методами. Кроме того, следует иметь в виду, что температурные сдвиги, участвующие в этом анализе, исключают точное определение того, сколько белка эндоцитозу для каждого возрастания времени, особенно в случае быстро интернализованных или быстро рециркулирующих белков. Поэтому анализ дает только полуколичественную оценку показателей эндоцитов. Общая флуоресцентная микроскопия внутреннего отражения может использоваться для отслеживания поглощения каждого загруженного везикула и обеспечения более точного измерения кинетики эндоцитоза. Поэтому он может служить очень полезным дополнением к этому анализу, предполагая, что имеется флуоресцентно меченная химерная конструкция представляющего интерес белка 11 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="773">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">A661-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Bromophenol blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">cOmplete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:129px;">#1610729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Iodoacetamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#163-2109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Thaw on ice.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">L-glutamine</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Mouse monoclonal anti-&#946;-actin antibody (AC-15)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Mouse monoclonal anti-&#946;-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5)</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>B-DG-CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:219px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:219px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Reduced glutathione</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>862010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Streptavidin agarose resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody</td>
			<td>Alomone</td>
			<td>AQP-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Tris base (Trizma base)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining cell-surface expression and endocytic rate of proteins in primary astrocyte cultures using biotinylation

Белки клеточной поверхности опосредуют широкий спектр функций. Во многих случаях их активность регулируется эндоцитарными процессами, которые модулируют их уровни на плазматической мембране. Здесь мы приводим подробные протоколы для 2 методов, которые облегчают изучение таких процессов, оба из которых основаны на принципе биотинилирования белков клеточной поверхности. Первая из них предназначена для полуколичественного определения относительных уровней конкретного белка на поверхности клетки. В нем лизиновые остатки белков плазматической мембраны сначала мечены биотиновой частью. После того, как клетки лизируются, эти белки могут затем быть специально осаждены с использованием иммобилизованного агарозой стрептавидина, используя природную аффинность последнего для биотина. Белки, выделенные таким образом, затем могут быть проанализированы с помощью стандартного метода вестерн-блоттинга. Второй способ обеспечивает средство определения скорости эндоцитовAr-клеточной поверхности в течение определенного периода времени. Белки клеточной поверхности сначала модифицируют производным биотина, содержащим расщепляемую дисульфидную связь. Затем клетки переносятся обратно в нормальные условия культивирования, что приводит к поглощению эндоцитов доли биотинилированных белков. Затем дисульфидные связи неинниционированных групп биотина восстанавливаются с использованием мембранонепроницаемого восстановителя глутатиона. Благодаря этому подходу эндоцитозные белки могут быть выделены и количественно определены с высокой степенью специфичности.

Использование биотинилирования клеточной поверхности для оценки экспрессии AQP4 плазматической мембраны в астроцитах Обработанные ламинином культуры астроцитов и необработанные контрольные клетки подвергались биотинилированию на клеточной поверхнос...

Watch this Scientific Journal Video about Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation at JoVE.com

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

В этом отчете представлены два метода на основе биотинилирования, предназначенных для определения экспрессии клеток и эндоцитарной скорости белков, экспрессируемых в плазматической мембране.

Определение экспрессии клеточной поверхности и эндоцитарной скорости белков в культурах первичных астроцитов с использованием биотинилирования

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

После вложения Immunogold маркировки синаптические белки в гиппокампе культур Slice

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Дифференциальный Маркировка клеточной поверхности и интернализированных белков после антитела Кормление Живая культивируемых нейронов

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Мозг Slice Биотинилирование:<em&gt; Экс Vivo</em&gt; Подход к Измерьте Регион-специфический плазменным мембранный белок с торговлей взрослых нейронов

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

Быстрое Генотипирование животных Круги путем создания первичных культурах мозга нейронов

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Простой и недорогой метод для определения холодную чувствительность и адаптация в мышах

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Оценка первичного нейрогенеза в<em&gt; Xenopus</em&gt; Эмбрионы Использование Иммунологическое

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

Надежная идентификация живых дофаминергических нейронов в мозге культур с использованием РНК-секвенирования и TH-промотор-приводом EGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Роман В Vitro Live изображений Assay экзоцитоз-опосредованной с помощью фагоцитоза pH индикатор конъюгированных синаптосомах

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

В естественных условиях Целевые выражение Optogenetic белков с помощью шелка/AAV фильмы

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Определение клеточных поверхностных маркеров первичных нейронных стволовых и клеток-прародителей путем метаболической маркировки сиалогликан

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...