Name: determining cell-surface expression and endocytic rate of proteins in primary astrocyte cultures using biotinylation
Uploaded: 2017-07-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation at JoVE.com

Bu proje, Kanada Sağlık Araştırma Enstitüsü PG # 20R47867 tarafından desteklenmiştir.

1. Astrositlerdeki Bağıl Hücre-Yüzey Protein Ekspresyonunun Biyotinleme ile Saptanması NOT: Burada, bu biyotinleme tekniğinin hücre geçirgen matris molekülünün laminin&#39;in su geçirgen kanal aquaporin-4&#39;ün (AQP4) hücre yüzeyi lokalizasyonu üzerindeki etkisinin incelenmesine uygulanışını göstermektedir. Bu deney için gereken uzmanlık gerektiren materyaller arasında sülfo-NHS-LC-biyotin ve streptavidin-agaroz reçinesi bulunur (bkz . Malzeme Tablosu</strong...

<ol>
	<li>Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transforming+growth+factor+beta+1+inhibits+epidermal+growth+factor+receptor+endocytosis+and+down-regulation+in+cultured+fetal+rat+hepatocytes.">Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes.</a> J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).</li><li>Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor-mediated+internalization+of+fluorescent+gonadotropin-releasing+hormone+by+pituitary+gonadotropes.">Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).</li><li>Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transferrin+uptake+and+release+by+reticulocytes+treated+with+proteolytic+enzymes+and+neuraminidase.">Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase.</a> Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).</li><li>Katsura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+and+regulated+membrane+expression+of+aquaporin+1+and+aquaporin+2+water+channels+in+stably+transfected+LLC-PK1+epithelial+cells.">Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).</li><li>Li, Y., Cam, J., Bu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-density+lipoprotein+receptor+family:+endocytosis+and+signal+transduction.">Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction.</a> Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).</li><li>Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+possible+identity+of+vitamin+H+with+biotin+and+coenzyme+R.">The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R.</a> Science. 91 (2358), 243-245 (1940).</li><li>Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation:+an+alternative+to+radioiodination+for+the+identification+of+cell+surface+antigens+in+immunoprecipitates.">Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates.</a> Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).</li><li>Green, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin+1.+the+use+of+[14-C]biotin+for+kinetic+studies+and+for+assay.">Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay.</a> Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).</li><li>Korpela, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avidin,+a+high+affinity+biotin-binding+protein,+as+a+tool+and+subject+of+biological+research.">Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research.</a> Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+pHluorin-tagged+receptor+insertion+to+the+plasma+membrane+in+primary+cultured+mouse+neurons.">Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons.</a> J Vis Exp. (69), e4450 (2012).</li><li>Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+clathrin-mediated+endocytosis+of+G+protein-coupled+receptors+at+single-event+resolution+via+TIRF+microscopy.">Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy.</a> J Vis Exp. (92), e51805 (2014).</li><li>Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interdependence+of+laminin-mediated+clustering+of+lipid+rafts+and+the+dystrophin+complex+in+astrocytes.">Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes.</a> J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li><li>Madrid, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+trafficking+and+surface+expression+of+the+AQP4+water+channel+are+coordinated+by+serial+and+regulated+interactions+with+different+clathrin-adaptor+complexes.">Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes.</a> EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).</li><li>Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquaporin-4+Cell-Surface+Expression+and+Turnover+Are+Regulated+by+Dystroglycan,+Dynamin,+and+the+Extracellular+Matrix+in+Astrocytes.">Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes.</a> PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).</li></ol>

Değişiklikler: Bu yöntemler yapışık hücrelerle birlikte kullanılmak üzere tasarlandığından, 100 mg / L MgCl2 · 6H20 ve Yıkama basamakları için ve hücrelerin kültür yüzeyine yapışmış olmasını ve hücre-hücresi bağlantılarının bozulmamasını sağlamak için belirli tamponların tabanı olarak, 100 mg / L CaCI2 (CM-PBS). Bununla birlikte, protokoller, hücreler prosedürünün her bir adımı arasında pelet yapılıyorsa, yapışkan olmay...

Hücrenin yüzeyindeki proteinler, hücre işlevini sürdürmek için merkezi rol oynarlar. Birçok durumda, bunların aktiviteleri, onları geçici olarak hücre içi bölgede tutan ya da bozunma yolları 1 , 2 , 3 , 4 , 5&#39;e yönlendiren endositik süreçlere bağlıdır veya modüle edilir. Burada, kullanıcıya, plazma zarında eksprese edilen proteinleri ve yeni içselleştirilen proteinleri özel olarak etiketlemek ve izole etmek için tasarlanmış 2 biyotinilasyon temelli yaklaşımları vurguluyoruz. Bu yöntemlerle, ilgili herhangi bir proteinin hücre yüzeyi ekspresyonu ve endositik oranı nicelleştirilebilir, böylece düzenlenmesinin daha net bir şekilde değerlendirilmesi mümkün olur. Bağıl hücre yüzeyi protein ekspresyonunun biyotinleme ile belirlenmesi Eskiden H6 vitamini olarak bilinen biyotin veya vitamin B7, biyolojik moleküllerin reaktif amin, sülfhidril ve karboksil gruplarını kimyasal olarak değiştirmek için kullanılabilen küçük bir suda çözünür moleküldür. Şu anki hücre yüzey biyotinilasyon reaktiflerinin mahsulü, esas itibariyle, eksprese edilen proteinlerin lisin tortularının yan zincirlerinde bulunan aminlerle reaksiyona girmek üzere tasarlanmış biyotinin veya türevlerinin membran geçirmeyen sülfonatlanmış N-hidroksisuksinimid (sülfo-NHS) esterlerini içerir. Bunlar, bazik koşullar altında protonsuz hale geldiğinde, hücre yüzeyi, ikinci durumda, biyotin kısmı 7 ile bir amid bağı oluştururlar. Böylece, modifiye edilmiş hücre yüzeyi proteinleri, daha sonra yaklaşık olarak 10-15&#39;lik bir ayrışma sabitiyle biyoinine bağlanan 66-69 kDa tetramerik bir protein olan avidin&#39;i kullanarak izole edilerek Bilinen en güçlü kovalent olmayan etkileşimler </suP&gt; , 9 . Önceki çalışmalarda, hücre yüzeyinde protein ekspresyonunu nicelendiren bir dizi alternatif yöntem kullanılmıştır. Örneğin, ilgi konusu protein için spesifik olan floresan etiketli antikorları, ardından flüoresan mikroskopisi ile görselleştirmeyi kullanarak, geçirimsiz hale getirilmiş hücrelerin etiketlenmesi yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım olmakla birlikte, hücre dışı epitoplara bağlanabilen antikorların bulunabilirliğine büyük ölçüde bağımlıdır. Daha yakın zamanlarda, asidik ortamlara maruz bırakılmaya tepkiyen pH duyarlı florofor taşıyan kimerik proteinlerin kullanılmasını içeren yöntemler de başarılı bir şekilde kullanıldı. Bununla birlikte, bu tür tahliller, genellikle, bu yapıların, ilgi proteininin doğal olarak bulunmadığı hücre çizgilerinde eksojen ifadesini içerir. Bu yaklaşımlar yine de, subselüler lokalizasyon ve ekzositik güzergah ile ilgili değerli bilgiler sağlayabilmektedirHedef protein içerir ve bu nedenle burada açıklanan biyotinilasyon temelli yaklaşımlarla bağlantılı olarak kullanılmalıdır. Tipik bir biyotinilasyon tahlilinde hücreler ilk olarak 4 ° C PBS&#39;de iyice yıkanır. Bu, kültür ortamı tarafından eklenen serum proteinlerinin izlerini kaldırır ve böylece bir sonraki aşamada bu miktarların fazla miktarda biyotini tüketmesini önler. Daha da önemlisi, sıcaklıktaki düşüş, endositozun önemli ölçüde yavaşlamasına neden olur. Daha sonra biyotinleme reaktifi eklenir. Daha sonra, hücreler yeniden yıkanır ve daha sonra geri kalan tüm biyotin izlerini inaktive etmek amacı olan ya glisin ya da NH4Cl içeren bir söndürme tamponu ile inkübe edilir. Daha sonra hücreler ayrıştırılır ve ardından biyotinlenmiş proteinlerin çökeltilmesi için agaroz-hareketsiz streptavidin ilave edilir. Analiz, yaygın olarak çeşitli prin bağıl hücre yüzeyi ekspresyonuna izin vererek, western blotting yoluyla gerçekleştirilirSayısallaştırılacak oteinler. Bu tahlilin temeli nedeniyle, sadece hücre dışı çevreye maruz kalan kısımlara sahip olan proteinler ile kullanım için uygundur. Muhtemelen döngü bölgelerinde bir takım reaktif lizinlere sahip olan çok katlı transmembran proteinleri, bu yöntem için en uygun yöntemdir; tek geçişli proteinler ise biyotinilasyona daha az duyarlı olma eğilimindedir. Bu durumlarda dahi, yapısal değişiklikler veya moleküller arası etkileşimlerin belirli reaktif bölgeleri tıkayarak beklenenden düşük bir biyotinilasyon verimi oluşturması olasılığı söz konusudur. Biyotinleme ile hücre yüzey proteinlerinin içselleştirme oranının belirlenmesi Bu tahlilin prensipleri, bir takım istisna dışında, hücre yüzeyinde biyotinilasyon ile büyük oranda benzerdir; bunların en önemlisi, tersinir biyotinilasyon reaktiflerinin kullanılmasıdır. Biyotin grupları (bunların) disuYapılarında, indirgeyici ajanlara duyarlı bağlar bağlanır; Bu, tahlil süresi boyunca hücre içi sitelere alınan sadece hücre yüzeyi proteinlerinin biyotinile bırakılmasını sağlamak için kullanılır. Bir analiz genel olarak aşağıdaki şekilde gerçekleşir. Hücreler önce yıkanır ve soğuk reaktiflerle biyotinlenir, daha sonra 37 ° C&#39;de hücre kültürü ortamı yeniden verilir ve hücreler kuluçka makinesine geri gönderilir; Bu etiketli hücre yüzeyi proteinlerinin endositozuna uğramasına neden olur. Zara nüfuz etmeyen indirgeyici madde glutatyon daha sonra hücre yüzeyi üzerinde kalan proteinlere bağlı olan biyotin parçalarının disülfid bağlarını kırmak için eklenir. Sonunda, bozulmuş disülfür bağları, iyodoasetamid ile reaksiyona girerek, labil tiol gruplarını tüketir ve bağların reformasyonunu önler. Daha önce olduğu gibi, hücreler daha sonra lizlenir ve etiketli proteinler streptavidin-agaroz kullanılarak çöktürülür. Disk sınırlamalarıYöntemler arasında paylaşılan benzerlikler nedeniyle burada da geçerlidir. Buna ek olarak, bu tahlilde yer alan sıcaklık değişimlerinin, özellikle hızlı içselleştirilen veya hızla geri dönüşümlü proteinlerin olması durumunda, her zaman artışı için ne kadar proteinin sitoplazma edildiğinin tam olarak belirlenmesini engellemesi akılda tutulmalıdır. Bu nedenle tahlil, sadece endositik hızların semikantitatif bir kestirimini sağlar. Toplam iç yansıma flüoresan mikroskopisi, yüklü veziküllerin alımını izlemek ve endositoz kinetiğini daha kesin bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Bu nedenle, ilgilenilen proteinin floresan etiketli kimerik yapısı bulunduğunu farz ederek, bu tahlil için çok faydalı bir tamamlayıcı madde sağlayabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="773">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Ammonium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:219px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">A661-500</td>
			<td style="width:147px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9647-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Bromophenol blue</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">cOmplete protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11697498001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Disodium ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td style="width:129px;">#1610729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#1610611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11960-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#21331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP229-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8898&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Iodoacetamide</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>#163-2109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td>Thaw on ice.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">L-glutamine</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Mouse monoclonal anti-&#946;-actin antibody (AC-15)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Mouse monoclonal anti-&#946;-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5)</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>B-DG-CE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:219px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:219px;">Jackson ImmunoResearch Laboratories</td>
			<td>111-035-045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Phosphate buffer saline</td>
			<td>Gibco/Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Reduced glutathione</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G6529</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S271-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>862010&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Sodium hydroxide (NaOH)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S318-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Streptavidin agarose resin</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>#20347</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody</td>
			<td>Alomone</td>
			<td>AQP-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Tris base (Trizma base)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP153-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:280px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining cell-surface expression and endocytic rate of proteins in primary astrocyte cultures using biotinylation

Hücre yüzey proteinleri çok çeşitli fonksiyonlara aracılık eder. Çoğu durumda, faaliyetleri plazma membranındaki seviyelerini modüle eden endositik işlemlerle düzenlenir. Burada, bu süreçlerin çalışmasını kolaylaştıran 2 yöntem için ayrıntılı protokoller sunuyoruz, her ikisi de hücre yüzeyi proteinlerinin biyotinleştirilmesi ilkesine dayanmaktadır. İlki hücre yüzeyinde belirli bir proteinin göreli düzeylerinin yarı niceliksel olarak belirlenmesine izin vermek için tasarlanmıştır. İçinde hücrelerin plazma membran proteinlerinin lisin artıkları önce bir biotin kısmı ile etiketlenir. Hücreler ayrıldıktan sonra, bu proteinler daha sonra agarozla hareketsiz hale getirilen streptavidin kullanımı ile biyotin için ikinci afinitenin doğal afinitesini istifade ederek spesifik olarak çöktürülebilir. Böyle bir şekilde izole edilen proteinler daha sonra standart bir western blotlama yaklaşımı ile analiz edilebilir. İkinci yöntem, bir partikülün endositik hızını belirleme aracı sağlarAr hücre yüzeyi hedefinin belirli bir zaman süresi boyunca. Hücre yüzey proteinleri, ilk olarak, bölünebilir bir disülfid bağı içeren bir biyotin türevi ile modifiye edilir. Hücreler daha sonra biyotinlenmiş proteinlerin bir kısmının endositik alımına neden olan normal kültür koşullarına geri kaydırılır. Daha sonra, içe geçmemiş biyotin gruplarının disülfür bağları, membrana geçirimsiz redüksiyon maddesi glutatyon kullanılarak indirgenir. Bu yaklaşım vasıtasıyla, endositize proteinler izole edilebilir ve yüksek bir özgüllük derecesi ile nicelleştirilebilir.

Astrositlerdeki AQP4&#39;ün plazma membran ekspresyonunu değerlendirmek için hücre yüzeyi biotinilasyonunun kullanılması Laminin ile muamele edilmiş astrosit kültürleri ve muamele edilmemiş kontrol hücreleri tarif edilen yöntemler kullanılarak hücre yüzeyi biotinilasyonuna tabi tutuldu. Biyotinlenmiş proteinler, agaroz-konjuge streptavidin ile çöktürüldü ve daha sonra SDS-PAGE vasıtasıyla ayrıldı. Hücre yüzeyi fraksiyonları AQP4 ve β-...

Watch this Scientific Journal Video about Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation at JoVE.com

Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation

Bu raporda, plazma membranında eksprese edilen proteinlerin hücre yüzeyi ekspresyonunu ve endositik hızını belirlemek için tasarlanan iki biyotinilasyona dayalı yöntemler sunulmuştur.

Primer Astrosit Kültürlerinde Proteinlerin Hücre-Yüzey İfadesi ve Endosit Oranının Biyotinleme Yöntemiyle Belirlenmesi

Cell-surface proteins mediate a wide array of functions. In many cases, their activity is regulated by endocytic processes that modulate their levels at ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Hipokampal Dilim Kültürleri Synaptic Proteinler Post-gömme immunogold Etiketleme

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Differential Labeling of Cell-surface and Internalized Proteins after Antibody Feeding of Live Cultured Neurons

Canlı Kültür Nöronlar Antikor Besleme sonra Hücre-yüzey ve İçselleştirilmiş Proteinlerin Diferansiyel Etiketleme

In order to demonstrate the cell-surface localization of a putative transmembrane receptor in cultured neurons, we labeled the protein on the surface of ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em&gt; Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir&gt; Yaklaşım

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Rapid Genotyping of Animals Followed by Establishing Primary Cultures of Brain Neurons

Hayvanlar Rapid Genotipleme Beyin Nöronlar İlköğretim Kültürler kurulması izledi

High-resolution analysis of the morphology and function of mammalian neurons often requires the genotyping of individual animals followed by the analysis ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Fareler Soğuk Hassasiyeti ve Uyum belirlenmesi için Basit ve ucuz Yöntem

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

İlköğretim nöron değerlendirilmesi<em&gt; Xenopus</em&gt; Embriyolar kullanarak immün

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

RNA sıralaması ve TH-organizatörü odaklı eGFP İfade Kullanımı orta beyin Kültürlerde Yaşayan dopaminerjik nöronlar güvenilir Kimlik

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

A Novel In Vitro Live-imaging Assay of Astrocyte-mediated Phagocytosis Using pH Indicator-conjugated Synaptosomes

Bir roman In Vitro canlı görüntüleme Astrocyte tahlil-aracılı fagositoz kullanarak pH göstergesi Birleşik Synaptosomes

Astrocytes are the major cell type in the brain and directly contact synapses and blood vessels. Although microglial cells have been considered the major ...

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Vivo Optogenetic proteinlerin ipek/AAV filmleri kullanarak hedeflenen ifade

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

Identifying Cell Surface Markers of Primary Neural Stem and Progenitor Cells by Metabolic Labeling of Sialoglycan

Primer Nöral Kök ve Progenitor Hücrelerinin Hücre Yüzey Belirteçlerinin Sialoglycan'ın Metabolik Etiketlemesi ile Belirlenmesi

Neural stem and progenitor cells (NSPCs) are the cellular basis for the complex structures and functions of the brain. They are located in specialized ...