Name: in vitro ovule cultivation for live-cell imaging of zygote polarization and embryo patterning in arabidopsis thaliana
Uploaded: 2017-09-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Mikroskopi i dette arbejde var udført på Institut for Transformative Bio-molekyler (WPI-ITbM) Nagoya University og understøttes af Japan avanceret anlæg videnskab netværk. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Japan videnskab og teknologi Agency (ERATO projekt til T.H. og M.U.) og fra Japan-samfund til fremme af videnskab: en licensbetaling for videnskabelig forskning på Innovative områder (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 og JP15H05955 for M.U. og Nos. JP16H06465, JP16H06464 og JP16K21727 for T.H), en licensbetaling for unge forskere (B, nr. JP24770045 og JP26840093 for M.U.), og en licensbetaling for udfordrende sonderende forskning (nr. JP16K14753 for M.U.).

1. forberedelse af dyrkningsmediet In Vitro Ovule <ol><li>gøre det flydende miljoe for in vitro- ovule kultur (&#34; N5T medium &#34;) indeholdende 1 x Nitsch basal salt blanding, 5% (w/v) trehalose dihydrat, 0,05 % (w/v) 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre (MES)-KOH (pH 5,8), og 1 x Gamborg &#39; s vitamin løsning.</li>
	<li>PH indstilles til 5.8 med KOH.</li>
	<li>Sterilisere medium ved autoklavering (121 ° C, 20 min) eller filtrere det gennem et 0,22 µm filter. 
	Bemærk: Steriliseret me...

<ol>
	<li>Natesh, S., Rau, M. A., Johri, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Embryology of Angiosperms. , 377-443 (1984).</li><li>Kranz, E., Lorz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilisation+of+maize+by+single+egg+and+sperm+cell+protoplast+fusion+mediated+by+high+calcium+and+high+pH.">In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH.</a> Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).</li><li>Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+in+vitro+fertilization+system+in+rice+(Oryza+sativa+L.).">Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.).</a> Planta. 226 (3), 581-589 (2007).</li><li>Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+double+fertilization+in+Nicotiana+tabacum+(L.):+the+role+of+cell+volume+in+cell+fusion.">In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion.</a> Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).</li><li>Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+double+fertilization+and+the+cell+cycle+in+male+and+female+gametes+of+tobacco.">Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco.</a> Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).</li><li>Costa, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+cell-derived+peptides+regulate+early+embryo+patterning+in+flowering+plants.">Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants.</a> Science. 344 (6180), 168-172 (2014).</li><li>Sauer, M., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+Arabidopsis+embryos+within+their+ovules.">In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules.</a> Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).</li><li>Gooh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+optical+manipulation+of+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis.</a> Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).</li><li>Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microcage+arrays+to+fix+plant+ovules+for+long-term+live+imaging+and+observation.">Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation.</a> Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).</li><li>Kimata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+dynamics+control+the+first+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis+zygote.">Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).</li><li>Nambo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Synthetic+Chemistry+and+Live-Cell+Imaging+Identified+a+Rapid+Cell+Division+Inhibitor+in+Tobacco+and+Arabidopsis+thaliana.">Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).</li><li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues.">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).</li></ol>

Dette manuskript introducerer en enkel in vitro- ovule dyrkning protokol, der er effektiv til brug i live-celle imaging for at udvikle zygotes og embryoner.
Design af enhedens PDMS muligvis optimering efter den embryonale fase. Den første udviklede enhed var en microcage array til at justere retningen og til at fastsætte placeringen af ovules9, og derefter en micropillar enhed blev bygget for at fælde æganlæg mere effektivt8. Desude...

Den grundlæggende kroppen plan af en organisme udvikler sig fra en encellet zygote. I de fleste blomstrende planter genererer zygotisk division en apikale og en basal celle, som udvikles til at skyde og rod, henholdsvis1. Derfor er det vigtigt at forstå hvordan selve planten er dannet under embryogenese, men der har ikke været et effektivt redskab til direkte observere dynamikken i levende zygotes og embryoner, fordi de udvikler dybt inde i blomsten. I flere monocot arter, såsom majs og ris, er en in vitro- befrugtning metode blevet etableret2,3. I denne metode, isolerede sæd- og ægceller er smeltet elektrisk eller kemisk og den genererede celle kan udvikle sig til en frugtbar plante. I dicot planter er der imidlertid ingen in vitro- befrugtning metode, der kan producere ordentlig embryoner, formentlig på grund af den ikke-synkroniseret cellecyklus tilstand af mandlige og kvindelige mælke4,5. Derudover spiller embryo-omkringliggende væv (endosperm) vigtige roller i embryo udvikling6.
I en model dicot arter, A. thaliana, blev en i vitro dyrkning metode udviklet ved at fokusere på hele ovule, som indeholder både Foster og frøhvide7. Dette system blev med held bruges til at analysere virkningerne af forskellige kemiske reagenser på embryogenese, men det er ikke egnet for time-lapse imaging, fordi det har en lav overlevelsesrate. Derfor, en roman i vitro ovule dyrkning systemet blev udviklet for at starte så tidligt som zygote fase og producere frugtbare planter på en høj forholdet8. Efter forskellige forsøg, det blev konstateret, at Nitsch medium og trehalose væsentligt forbedret overlevelsesraten for æganlæggene8. Derudover fordi ovule udvider som det vokser og dermed ofte bevæger sig væk fra feltet observation af mikroskopet, blev en PDMS enhed udviklet for at løse ovule i medium9. PDMS enheden aktiveret den langsigtede imaging for 3-4 dage, hvilket er tilstrækkeligt til at spore udviklingen fra en zygote til en hjerte-fase embryo. Brug denne metode, bliver det muligt at visualisere dynamikken i zygote polarisering og embryo mønster, ikke kun under normale forhold, men også i nærværelse af kemiske hæmmere eller i forskellige mutant baggrunde8,10 ,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig1.jpg"> 
Figur 1: Skematisk Diagram over den specifikke fluorescerende markører, der anvendes til at visualisere Zygotes og embryoner gennem Ovule. Arabidopsis zygote udvikler sig til et foster i ovule, som genereres dybt inde i blomsten. I dette in vitro dyrkning systemet, befrugtede æg og embryo er observeret gennem ovule, og derfor er det vigtigt at bruge specifikke fluorescerende markører, der ikke er udtrykt i andre ovule væv. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig1large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table width="606">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">Nitsch basal salt mixture</td>
			<td style="width:104px;">Duchefa</td>
			<td style="width:119px;">N0223</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">trehalose dihydrate</td>
			<td style="width:104px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:119px;">206-18455</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">MES</td>
			<td style="width:104px;">Dojindo</td>
			<td style="width:119px;">345-01625</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">Gamborg&#8217;s vitamin solution</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1019</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">35-mm glass-bottom dish</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">D111300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">35 mm culture dish</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430588</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">PDMS</td>
			<td style="width:104px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard184</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">76 &#215; 26 mm slide glass</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">S1225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">18 &#215; 18 mm slide glass</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">C018181</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">needle (gauge 0.40mm)</td>
			<td style="width:104px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">NN-2719S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td style="width:104px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">444969-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">A1R MP</td>
			<td style="width:104px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="width:216px;height:84px;">CSU-W1</td>
			<td style="width:104px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">CV1000</td>
			<td style="width:104px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;">CV1000-SP84</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ovule cultivation for live-cell imaging of zygote polarization and embryo patterning in arabidopsis thaliana

I de fleste blomstrende planter, befrugtede æg og embryo er skjult dybt inde i mor væv, og dermed har det længe været et mysterium af hvordan de udvikler sig dynamisk; for eksempel, hvordan zygote polarizes for at fastslå kroppens akse og hvordan fosteret angiver forskellige celle skæbner under orgel dannelse. Dette manuskript beskriver en in vitro- ovule kultur metode for at udføre live-celle imaging for at udvikle zygotes og embryoner fra Arabidopsis thaliana. Optimeret dyrkning medium tillader zygotes eller tidlige embryoner til at vokse i frodige planter. Ved at kombinere det med en poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array enhed, afholdes ovule i Lage i samme situation. Denne fiksering er afgørende for at observere den samme ovule under et mikroskop i flere dage fra zygotisk division til embryo sent. Den resulterende live-celle billedbehandling kan bruges til at overvåge real-time dynamikken i zygote polarisering, som nukleare migration og cytoskeleton omlejring, og også celledeling timing og celle skæbne specifikation under embryo mønstre. Desuden, denne ovule dyrkning systemet kan kombineres med hæmmer behandlinger til at analysere forskellige faktorer virkninger på embryo udvikling og optisk manipulationer såsom laser forstyrrelser til at undersøge rollen i celle-celle kommunikation.

Ved hjælp af denne ovule dyrkning system, kan denne metode spore levende dynamics zygote polarisering og embryo mønstre. Dette er en præstation, fordi tidligere var der ingen teknik til at visualisere de real-time opførsel af befrugtede æg og embryoner, som er skjult dybt inde i mor væv. Figur 3A og supplerende Video 1 vis at mikrotubuli (MTs) i den unge zygote ophobes som et tværgående ring i subapical regionen10</s...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Dette manuskript beskriver en in vitro- ovule dyrkning metode, der muliggør live-celle billeddannelse af Arabidopsis zygotes og embryoner. Denne metode er udnyttet til at visualisere den intracellulære dynamics under zygote polarisering og celle skæbne specifikation i udviklingen af embryoner.

In Vitro Ovule dyrkning for Live-celle Imaging af Zygote polarisering og Embryo mønstre i Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Karakterisering af tymisk Bundfældning Progenitorer i Mouse Embryo Brug<em&gt; In vivo</em&gt; Og<em&gt; In vitro</em&gt; Analyser

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging Subcellulære Strukturer i Living Zebrafisk Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

In vitro Differentiering af Ældre -myofibre til Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Lev Konfokal Imaging af Udvikling Arabidopsis Blomster

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

En metode til kendetegner embryogenese i Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Masse Isolation og In Vitro dyrkning af Intramolluscan faser af den menneskelige blod Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende celle billeddannelse af kromosom Segregation under mitosen

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimalt invasivt Embryo Transfer og embryo Vitrificering på det optimale embryo stadie i kanin model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Levende billeddannelse og analyse af muskelsammentrækninger i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...