Name: in vitro ovule cultivation for live-cell imaging of zygote polarization and embryo patterning in arabidopsis thaliana
Uploaded: 2017-09-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

この作品での顕微鏡で、研究所のトランスフォーマティブ生命分子 (WPI ITbM) 名古屋大学を行われ、日本高等植物科学ネットワークでサポートされています。この作品は、振興会の日本科学技術振興機構 (ERATO プロジェクト ノルウェールーテルし調印) 会からの助成金によって支えられた: 革新的な領域 (Nos 科学研究費補助金。JP24113514、JP26113710、JP15H05962、および調印、および Nos JP15H05955。JP16H06465、JP16H06464、T.H の JP16K21727)、科研費若手 (B、Nos。JP24770045 と調印の JP26840093)、科研費挑戦的萌芽研究号調印の JP16K14753)。

1 体外 胚珠培養培地の調製 <ol><li>を 体外 の胚珠培養用液体培地 (&#34; N5T 中 &#34;) 1 x Nitsch 基底塩混合物、5% (w/v) トレハロース二水和物、0.05 を含む。% (w/v) の 2-(N morpholino) ethanesulfonic 酸 (MES)-島 (pH 5.8) 1 x Gamborg &#39; s ビタミン ソリューションです</li>。
	<li>島の 5.8 に pH を調整します</li>。
	<li>は、オートクレーブに入れることによって媒体を滅菌 (121 ° C、20 分) または、0.22 μ m...

<ol>
	<li>Natesh, S., Rau, M. A., Johri, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Embryology of Angiosperms. , 377-443 (1984).</li><li>Kranz, E., Lorz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilisation+of+maize+by+single+egg+and+sperm+cell+protoplast+fusion+mediated+by+high+calcium+and+high+pH.">In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH.</a> Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).</li><li>Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+in+vitro+fertilization+system+in+rice+(Oryza+sativa+L.).">Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.).</a> Planta. 226 (3), 581-589 (2007).</li><li>Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+double+fertilization+in+Nicotiana+tabacum+(L.):+the+role+of+cell+volume+in+cell+fusion.">In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion.</a> Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).</li><li>Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+double+fertilization+and+the+cell+cycle+in+male+and+female+gametes+of+tobacco.">Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco.</a> Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).</li><li>Costa, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+cell-derived+peptides+regulate+early+embryo+patterning+in+flowering+plants.">Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants.</a> Science. 344 (6180), 168-172 (2014).</li><li>Sauer, M., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+Arabidopsis+embryos+within+their+ovules.">In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules.</a> Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).</li><li>Gooh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+optical+manipulation+of+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis.</a> Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).</li><li>Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microcage+arrays+to+fix+plant+ovules+for+long-term+live+imaging+and+observation.">Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation.</a> Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).</li><li>Kimata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+dynamics+control+the+first+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis+zygote.">Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).</li><li>Nambo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Synthetic+Chemistry+and+Live-Cell+Imaging+Identified+a+Rapid+Cell+Division+Inhibitor+in+Tobacco+and+Arabidopsis+thaliana.">Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).</li><li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues.">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).</li></ol>

本稿では、単純な体外胚珠栽培プロトコルは、受精卵や胚の開発の住セルイメージ投射で使用するため効率的を紹介します。
PDMS 装置の設計は、胚の段階に応じて最適化を必要があります。開発の最初のデバイスは microcage 配列方向を調整し、胚珠9の位置を修正してより効率的に胚珠をトラップし、駆動式マイクロピラー デバイスを構築しまし?...

単細胞受精卵から有機体の基本的なボディ計画を開発します。ほとんどの顕花植物のココヤシ部門は、樹状突起と撮影やルート、1それぞれに発展する基底のセルを生成します。したがって、胚発生に伴う植物体を形成する方法を理解することが重要だが、彼らは花に深く成長するのでリビング受精および胚のダイナミクスを直接観測する効果的なツールをされていません。トウモロコシ、米などのいくつかの単子葉種体外受精法は確立された2,3をされています。この方法では分離精子と卵細胞を電気的または化学的に、融合し、生成されたセル、肥沃な工場に開発。ただし、双子葉植物植物の雄性と雌性の配偶子の4、5の細胞周期の非同期状態のためおそらく適切な胚を作り出すことができる体外受精法ではありません。さらに、胚周囲組織 (胚乳) は、胚の開発6で重要な役割を果たしています。
モデルの双子葉植物の種、シロイヌナズナ、体外の栽培方法は、胚と胚乳の7を含む全体の胚珠に焦点を当てによって開発されました。このシステムは正常に様々 な化学試薬の胚発生に及ぼすを分析に使用されたが、低い生存率をもっているため時間経過イメージ投射のため適していません。そこで、新規培養胚珠の栽培システムは、受精卵の段階として早期に開始高比8で肥沃な植物を生成するために開発されました。様々 な試験後 Nitsch 培地が分かったし、トレハロースが胚珠8の生存率を大幅に向上します。さらに、胚珠の展開としては成長して、従って頻繁に顕微鏡の観察フィールドから移動、ために、9の中の胚珠を修正する PDMS 装置が開発されました。PDMS デバイスは、心期胚には受精卵から開発をトレースするのに十分である 3-4 日間の長期的なイメージングが有効になります。このメソッドを使用して、それは偏波受精卵・胚のパターンだけでなく通常の条件下でも低分子阻害剤の存在下でまたは様々 な突然変異体の背景8,10 のダイナミクスを可視化することが可能になります。 ,11。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig1.jpg"> 
図 1: 視覚化受精し胚を胚珠を使用特定の蛍光マーカーの模式図。 シロイヌナズナの受精卵は、花の奥深くに生成される胚珠の胚に開発しています。体外培養システム、受精卵・胚胚珠、観察、従って他の胚珠組織で表されない特定の蛍光マーカーを使用することが重要です。 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

<table width="606">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">Nitsch basal salt mixture</td>
			<td style="width:104px;">Duchefa</td>
			<td style="width:119px;">N0223</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">trehalose dihydrate</td>
			<td style="width:104px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:119px;">206-18455</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">MES</td>
			<td style="width:104px;">Dojindo</td>
			<td style="width:119px;">345-01625</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">Gamborg&#8217;s vitamin solution</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1019</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">35-mm glass-bottom dish</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">D111300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">35 mm culture dish</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430588</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">PDMS</td>
			<td style="width:104px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard184</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">76 &#215; 26 mm slide glass</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">S1225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">18 &#215; 18 mm slide glass</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">C018181</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">needle (gauge 0.40mm)</td>
			<td style="width:104px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">NN-2719S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td style="width:104px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">444969-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">A1R MP</td>
			<td style="width:104px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="width:216px;height:84px;">CSU-W1</td>
			<td style="width:104px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">CV1000</td>
			<td style="width:104px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;">CV1000-SP84</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ovule cultivation for live-cell imaging of zygote polarization and embryo patterning in arabidopsis thaliana

ほとんどの顕花植物の受精および胚は母組織の奥深くに隠されて、従ってそれは長年どのように彼らを動的に開発の謎たとえば、どのように受精は体軸や器官形成の時に胚が様々 な細胞運命を指定する方法を確立する分極します。本稿では、受精とシロイヌナズナの胚の開発の住セルイメージ投射を実行する胚珠体外培養法について説明します。最適化された培地では、受精卵や初期胚肥沃な植物に成長することができます。ポリジメチルシロキサン (PDMS) 駆動式マイクロピラー アレイ デバイスと組み合わせて、胚珠は同じ位置に液体培地で開催されます。この固定は、ココヤシの部門から数日間胚後期に顕微鏡下で同じ胚珠を観察することが重要です。結果住セルイメージ投射を使用して核移行と細胞骨格の再編とも細胞分裂のタイミングや胚パターン形成時の細胞運命仕様など、受精卵の偏波の実時間ダイナミクスを監視できます。さらに、胚発育に及ぼす諸因子の影響を分析する阻害剤治療と細胞間コミュニケーションの役割を調べるレーザー破壊などの光の操作は、この胚珠培養システムを結合できます。

このメソッドはこの胚珠培養システムを用いた偏波受精卵・胚パターン形成生活動態をトレースできます。これは、以前母親組織に深く隠されている受精卵及び胚のリアルタイム挙動を可視化する技術がなかったので成果です。図 3 aと補足のビデオ 1若い受精卵における微小管 (MTs) 穎地域10の横のリングとして蓄?...

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In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

本稿では体外胚珠栽培手法についてシロイヌナズナ受精および胚の住セルイメージ投射を可能にします。このメソッドを利用して、受精卵の偏波の中に細胞内動態と初期胚細胞運命決定を可視化します。

体外受精卵の Live 細胞イメージング偏光とシロイヌナズナの胚パターン形成の胚珠培養

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

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胸腺の特性を用いてマウス胚における前駆細胞をセトリング<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

リビングゼブラフィッシュ胚における細胞内構造のイメージング

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

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Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

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共焦点イメージングは​​、シロイヌナズナの花の開発のライブ

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Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

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ショウジョウバエ胚における筋収縮のライブイメージングと解析

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...