Name: in vitro ovule cultivation for live-cell imaging of zygote polarization and embryo patterning in arabidopsis thaliana
Uploaded: 2017-09-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

Mikroskopi i detta arbete utfördes på institutet av omvälvande Bio-molekyler (WPI-ITbM) Nagoya University och stöds av Japan avancerade Plant Science nätverket. Detta arbete stöds av bidrag från Japan Science och Technology Agency (ERATO projekt att T.H. och M.U.) och från Japan Society för främjande av vetenskap: ett bidrag för vetenskaplig forskning på innovativa områden (Nos. JP24113514, JP26113710, JP15H05962 och JP15H05955 för M.U. och Nos. JP16H06465, JP16H06464 och JP16K21727 för T.H), ett bidrag för unga forskare (B, Nos. JP24770045 och JP26840093 för M.U.), och ett bidrag för utmanande utforskande forskning (nr. JP16K14753 för M.U.).

1. beredning av odlingssubstratet In Vitro fröämnet <ol><li>göra det flytande mediet för den in vitro- fröämnet kultur (&#34; N5T medium &#34;) som innehåller 1 x Nitsch basala salt blandning, 5% (w/v) trehalosdihydrat, 0,05 % (w/v) 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syra (MES)-KOH (pH 5.8), och 1 x Gamborg &#39; s vitamin lösning.</li>
	<li>Justera pH-värdet till 5,8 med KOH.</li>
	<li>Sterilisera mediet i autoklav (121 ° C, 20 min) eller filtrera det genom ett filter med 0,22 µm. 
	Obs...

<ol>
	<li>Natesh, S., Rau, M. A., Johri, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Embryology of Angiosperms. , 377-443 (1984).</li><li>Kranz, E., Lorz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+fertilisation+of+maize+by+single+egg+and+sperm+cell+protoplast+fusion+mediated+by+high+calcium+and+high+pH.">In vitro fertilisation of maize by single egg and sperm cell protoplast fusion mediated by high calcium and high pH.</a> Zygote. 2 (2), 125-128 (1994).</li><li>Uchiumi, T., Uemura, I., Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+an+in+vitro+fertilization+system+in+rice+(Oryza+sativa+L.).">Establishment of an in vitro fertilization system in rice (Oryza sativa L.).</a> Planta. 226 (3), 581-589 (2007).</li><li>Sun, M. X., Moscatelli, A., Yang, H. Y., Cresti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+double+fertilization+in+Nicotiana+tabacum+(L.):+the+role+of+cell+volume+in+cell+fusion.">In vitro double fertilization in Nicotiana tabacum (L.): the role of cell volume in cell fusion.</a> Sex Plant Rep. 13 (4), 225-229 (2001).</li><li>Tian, H. Q., Yuan, T., Russell, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+double+fertilization+and+the+cell+cycle+in+male+and+female+gametes+of+tobacco.">Relationship between double fertilization and the cell cycle in male and female gametes of tobacco.</a> Sex Plant Rep. 17 (5), 243-252 (2004).</li><li>Costa, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+cell-derived+peptides+regulate+early+embryo+patterning+in+flowering+plants.">Central cell-derived peptides regulate early embryo patterning in flowering plants.</a> Science. 344 (6180), 168-172 (2014).</li><li>Sauer, M., Friml, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+culture+of+Arabidopsis+embryos+within+their+ovules.">In vitro culture of Arabidopsis embryos within their ovules.</a> Plant J. 40 (5), 835-843 (2004).</li><li>Gooh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+optical+manipulation+of+Arabidopsis+early+embryogenesis.">Live-cell imaging and optical manipulation of Arabidopsis early embryogenesis.</a> Dev Cell. 34 (2), 242-251 (2015).</li><li>Park, J., Kurihara, D., Higashiyama, T., Arata, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+microcage+arrays+to+fix+plant+ovules+for+long-term+live+imaging+and+observation.">Fabrication of microcage arrays to fix plant ovules for long-term live imaging and observation.</a> Sens Act B-Chem. 191, 178-185 (2014).</li><li>Kimata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoskeleton+dynamics+control+the+first+asymmetric+cell+division+in+Arabidopsis+zygote.">Cytoskeleton dynamics control the first asymmetric cell division in Arabidopsis zygote.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (49), 14157-14162 (2016).</li><li>Nambo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+Synthetic+Chemistry+and+Live-Cell+Imaging+Identified+a+Rapid+Cell+Division+Inhibitor+in+Tobacco+and+Arabidopsis+thaliana.">Combination of Synthetic Chemistry and Live-Cell Imaging Identified a Rapid Cell Division Inhibitor in Tobacco and Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell Physiol. 57 (11), 2255-2268 (2016).</li><li>Mizuta, Y., Kurihara, D., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+with+longer+wavelength+excitation+in+intact+Arabidopsis+tissues.">Two-photon imaging with longer wavelength excitation in intact Arabidopsis tissues.</a> Protoplasma. 252 (5), 1231-1240 (2015).</li></ol>

Detta manuskript introducerar ett enkelt in vitro- fröämnet odling protokoll som är effektiv för användning i av live-cell imaging att utveckla zygoter och embryon.
Utformningen av PDMS enheten behöva optimering enligt embryostadiet. Den första utveckla enheten var en microcage matris Justera orienteringen och fixar ståndpunkten av fröämnen9, och sedan en micropillar enhet konstruerades för att fälla fröämnen effektivare8. ...

Den grundläggande kropp planen av en organism utvecklas från en encellig zygot. I de flesta blommande växter genererar zygotic division en apikala och en basalcellscancer, som utvecklas till den skjuta och rot, respektive1. Därför är det viktigt att förstå hur växten kroppen bildas under embryogenes, men det har inte varit ett effektivt verktyg att direkt observera dynamiken i levande zygoter och embryon eftersom de utvecklas djupt i blomman. I flera enhjärtbladiga arter, såsom majs och ris, varit en in vitro- fertilisering metod etablerade2,3. I denna metod, isolerade spermier och äggceller är smält elektriskt eller kemiskt, och genererade cellen kan utvecklas till en bördig växt. Dock i Dikotyledon växter finns det ingen in vitro- fertilisering metod som kan producera korrekt embryon, förmodligen på grund av icke-synkroniserade cellcykeln staten av manliga och kvinnliga könsceller4,5. Dessutom spelar den embryo-omgivande vävnaden (frövita) viktiga roller i embryots utveckling6.
I en modell Dikotyledon art, A. thaliana, utvecklades en in vitro- odling metoden genom att fokusera på hela ägget, som innehåller både embryot och frövitan7. Detta system har framgångsrikt använts för att analysera effekterna av olika kemiska reagenser på embryogenes, men det passar inte för time-lapse imaging eftersom den har en låg överlevnad. Därför, en roman i vitro fröämnet odling utvecklades för att börja så tidigt som zygot scenen och producera fertila plantor på en hög andel8. Efter olika prövningar, konstaterades att Nitsch medium och trehalos avsevärt förbättrat överlevnaden av fröämnen8. Dessutom eftersom ägget expanderar när den växer och därmed ofta rör sig bort från fältet observation av Mikroskop, utvecklades en PDMS-enhet för att fixa ägget i medium9. PDMS enheten aktiverad av långsiktiga imaging för 3-4 dagar, vilket är tillräckligt för att spåra utvecklingen från en zygot till ett hjärta-scenen embryo. Med den här metoden blir det möjligt att visualisera dynamiken i zygot polarisering och embryo mönstring, inte bara under normala förhållanden, men också i närvaro av kemiska hämmare eller i olika muterade bakgrunder8,10 ,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55975/55975fig1.jpg"> 
Figur 1: Schematisk bild av de specifika fluorescerande markörer används för att visualisera zygoter och embryon genom the fröämnet. Arabidopsis zygoten utvecklas till ett embryo i ägget, som genereras djupt inne i blomman. Det zygote och embryo observeras genom ägget i in vitro- odling systemet, och därför är det viktigt att använda specifika fluorescerande markörer som inte uttrycks i andra fröämnet vävnader. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55975/55975fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>

<table width="606">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">Nitsch basal salt mixture</td>
			<td style="width:104px;">Duchefa</td>
			<td style="width:119px;">N0223</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">trehalose dihydrate</td>
			<td style="width:104px;">Wako Pure Chemical</td>
			<td style="width:119px;">206-18455</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">MES</td>
			<td style="width:104px;">Dojindo</td>
			<td style="width:119px;">345-01625</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">Gamborg&#8217;s vitamin solution</td>
			<td style="width:104px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G1019</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">35-mm glass-bottom dish</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">D111300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">35 mm culture dish</td>
			<td style="width:104px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">430588</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">PDMS</td>
			<td style="width:104px;">Dow Corning Co.</td>
			<td style="width:119px;">Sylgard184</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">76 &#215; 26 mm slide glass</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">S1225</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">18 &#215; 18 mm slide glass</td>
			<td style="width:104px;">Matsunami Glass</td>
			<td style="width:119px;">C018181</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:216px;height:21px;">needle (gauge 0.40mm)</td>
			<td style="width:104px;">Terumo</td>
			<td style="width:119px;">NN-2719S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">Immersion medium Immersol W 2010</td>
			<td style="width:104px;">Zeiss</td>
			<td style="width:119px;">444969-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">A1R MP</td>
			<td style="width:104px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;">A1RsiMP(1080) Ti-E-TIRF</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="width:216px;height:84px;">CSU-W1</td>
			<td style="width:104px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">It is a customized equipment, and thus Catalog Number is not avairable.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:216px;height:42px;">CV1000</td>
			<td style="width:104px;">Yokogawa Electric</td>
			<td style="width:119px;">CV1000-SP84</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro ovule cultivation for live-cell imaging of zygote polarization and embryo patterning in arabidopsis thaliana

I de flesta blommande växter, det zygote och embryo är gömda djupt i mor vävnaden, och därmed har det länge varit ett mysterium hur de utvecklas dynamiskt; exempelvis hur zygoten polariserar för att fastställa kropp axeln och hur embryot anger olika cell öden under organ kan bildas. Detta manuskript beskriver en in vitro- fröämnet kultur metod att utföra live-cell imaging att utveckla zygoter och embryon från Arabidopsis thaliana. Det optimera odling mediet tillåter zygoter eller tidiga embryon att växa till bördiga växter. Genom att kombinera det med en poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array enhet, hålls ägget i det flytande mediet i samma position. Denna fixering är avgörande att iaktta samma ägget under ett mikroskop för flera dagar från zygotic avdelningen att sena fosterstadiet. Den resulterande live-cell imaging kan användas för att övervaka i realtid dynamiken i zygot polarisering, såsom kärnkraft migration och cytoskelettet ombildning, och också celldelning tidpunkten och cell öde specifikation under embryo mallning. Detta fröämnet odling system kan dessutom kombineras med hämmare behandlingar att analysera effekterna av olika faktorer på embryots utveckling och med optisk manipulationer såsom laser störningar att undersöka rollen som cell-cell kommunikation.

Genom att använda detta system för odling av ägget, kan denna metod spåra levande dynamik zygot polarisering och embryo mallning. Detta är en prestation eftersom tidigare fanns det ingen teknik för att visualisera realtid beteende det zygote och embryot, som är gömda djupt i mor vävnaden. Figur 3A och kompletterande Video 1 visar att mitotiska (MTs) i unga zygoten ackumuleras som en tvärgående ring i trattformade region<sup class="...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana at JoVE.com

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Detta manuskript beskriver en in vitro- fröämnet odlingmetod som gör live-cell avbildning av Arabidopsis zygoter och embryon. Denna metod används för att visualisera den intracellulära dynamiken under zygot polarisering och specifikationen cell öde i utvecklingen av embryon.

In Vitro Fröämnet odling för Live-cell Imaging av zygot polarisering och Embryo mallning i Arabidopsis thaliana.

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Karakterisering av Thymic Settling stamfäder i Mouse Embryo Använda<em&gt; In Vivo</em&gt; Och<em&gt; In Vitro</em&gt; Analyser

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

Imaging subcellulära strukturer i vardagsZebraFish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

In vitro-differentiering av mogna Myofibers för Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

Live Confocal Imaging för att utveckla Arabidopsis blommor

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

A Method for Characterizing Embryogenesis in Arabidopsis

En metod för att karaktärisera embryogenes i Arabidopsis

Given the highly predictable nature of their development, Arabidopsis embryos have been used as a model for studies of morphogenesis in plants. However, ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Massa isolering och In Vitro -odling av Intramolluscan stadier av den mänskliga blod Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levande cellen avbildning av kromosomsegregering under Mitos

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Minimally Invasive Embryo Transfer and Embryo Vitrification at the Optimal Embryo Stage in Rabbit Model

Minimalinvasiv embryoöverföring och embryo-förglasning vid det optimala embryonala steget i Rabbit Model

Assisted reproductive techniques (ARTs), such as in vitro embryo culture or embryo cryopreservation, affect natural development patterns with perinatal ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Levande avbildning och analys av muskelsammandragningar i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...