Name: 3d microtissues for injectable regenerative therapy and high-throughput drug screening
Uploaded: 2017-10-04T11:45:00
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这项工作得到了中国国家自然科学基金的资助 (赠款: 81522022, 51461165302)。作者想感谢所有杜实验室的成员提供一般的帮助。

动物实验遵循了清华大学生物医学分析中心动物伦理委员会批准的严格的协议。在伦理委员会的批准下, 从北京协和医院整形外科部门获得了患者的知情同意, 得到了人体脂肪组织. 
 1. 制作 3D Microcryogels <ol> <li> microstencil 阵列芯片的设计和制作 <ol> <li> 使用商用软件设计特定几何图形的数组, 如圆、椭圆、三角形或草 14 , 具体取决于后续应用?...

再生医学和体外药物筛选模型是组织工程的两个重要应用:5,6,7,8,9。虽然这两种应用有着截然不同的需求, 但它们之间的共同点在于需要一个更具仿生的培养条件来增强细胞功能19。只有改进的细胞功能研究才能更好的治疗疾病20,<...

传统的细胞培养在平坦的 two-dimensional (2D) 表面, 如培养皿或井板, 很难引出细胞行为接近他们的本土状态。在三维 (3D) 体系结构中包含各种细胞类型、胞外基质和生物活性可溶性因子的环境的精确重述1,2,3 ,4, 对于组织工程、再生医学、基础生物学研究和药物发现的应用 (5、6、7),在体外构建 biomimicking 组织是必不可少的. ,8,9。
在2D 细胞培养中, 3D 细胞培养被广泛应用于培养细胞的仿生微结构和功能性特征的体外。流行的3D 单元格区域性方法是将单元格聚合为椭球7、8、9、10。细胞椭球可以注射到受伤的组织, 增强细胞的保留和生存相比, 注射的分散细胞。然而, 在注射过程中, 流体剪切力对细胞的非均匀球体大小和不可避免的机械损伤导致细胞治疗效果不佳11,12,13。同样, 在椭球聚合过程中固有的不均匀性使得他们的翻译为3D 细胞高通量药物筛选挑战10。
另一种3D 细胞培养方法是在生物材料的帮助下实现的, 它通常将水凝胶或多孔支架中的细胞封装起来。它允许在构建3D 体系结构时具有更大的灵活性。对于治疗, 细胞包裹在散装支架通常被送到动物身体通过外科植入, 这是侵入性和创伤, 因此限制其广泛的翻译到床边。另一方面, 水凝胶可以通过注射悬浮在水凝胶前体溶液中的细胞进入动物体内进行微创治疗, 使原位凝胶通过热, 化学或酶交联的11。然而, 当细胞被交付, 而水凝胶前体仍然在水状态时, 他们也暴露于机械剪在注射期间。不仅如此, 化学或酶交联过程中, 在原位凝胶的凝胶体也可能造成损害的细胞内。在药物筛选中, 生物材料辅助细胞培养面临着均匀性、可控性和吞吐量等问题。使用水凝胶, 细胞通常涉及在凝胶过程中, 这可能会影响细胞的活力和功能。在细胞播种过程中, 凝胶也会阻碍大多数高通量设备的使用, 因为水凝胶可能需要在冰层上保存, 以防止在细胞播种前凝胶, 而水凝胶可能堵塞配药技巧, 这通常非常薄, 以确保准确性高通量筛选。预成形的支架可能会将生物材料的制造过程从细胞培养中分离出来, 但是大多数 scaffold-based 的产品都可以作为相对较低吞吐量14的散装材料。
为了克服目前3D 文化方法的一些缺点, 我们开发了一种微加工-cryogelation 集成技术来制造现成的和 user-friendly 的 microcryogel 阵列芯片15。在本协议中, 选择明胶作为 microcryogel 制造技术的例证, 因为它具有生物相容性、可降解、cost-effective, 并且不需要对细胞附着进行进一步的修改。其他天然或合成来源的聚合物也可用于制造, 这取决于应用。通过这一技术, 我们可以制造小型化和高弹性 microcryogels 的大小, 形状和布局可控。当加载各种细胞类型, 3D microtissues 可以形成各种应用。这些独特的功能使理想的可, 细胞保护和现场定向保留后, 注入在体内, 以加强治疗效果。不仅如此, microcryogels 可以进一步处理, 形成 3D microtissue 阵列, 这是兼容的通用实验室设备和仪器, 以实现高通量细胞培养多功能药物筛选和其他细胞化验。在这里, 我们将详细介绍 microcryogels 及其后处理作为单独的 3D microtissues 或 3D microtissue 阵列用于两个重要的应用, 细胞治疗和药物筛选, 分别为10,15.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:199px;">Gelatin</td>
			<td style="width:211px;">sigma</td>
			<td style="width:111px;">G7041</td>
			<td style="width:283px;">All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated.</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:199px;">Glutaraldehyde&#160;</td>
			<td style="width:211px;">J&#38;K</td>
			<td style="width:111px;">902042</td>
			<td style="width:283px;">Used as crosslinker in preparation of material.</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:199px;">Glass cover slip (24X50mm)</td>
			<td style="width:211px;">CITOGLASS, China</td>
			<td style="width:111px;">10212450C</td>
			<td style="width:283px;">To scrape prcursor solution onto microstencils array chips.</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:199px;">Sodium&#160;borohydride, NaBH4</td>
			<td style="width:211px;">Beijing Chemical Works</td>
			<td style="width:111px;">116-8</td>
			<td style="width:283px;">To wash remaining glutaraldehyde away after gelation.</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:199px;">Vacuum jar</td>
			<td style="width:211px;">asperts, China</td>
			<td style="width:111px;">VC8130</td>
			<td style="width:283px;">To preserve microgels under vacuum.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sunjin Electronics Co., Ltd, China</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:283px;">Ordinary PMMA sheets.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Rayjet laser system</td>
			<td style="width:211px;">Rayjet, Australia</td>
			<td style="width:111px;">Rayjet 50 C30</td>
			<td style="width:283px;">To engrave PMMA sheets to form wells.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Plasma Cleaner</td>
			<td style="width:211px;">Mycro Technologies, USA</td>
			<td style="width:111px;">PDC-32G</td>
			<td style="width:283px;">To make PMMA hyphophilic.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Lyophilizer</td>
			<td style="width:211px;">Boyikang, China</td>
			<td style="width:111px;">SC21CL</td>
			<td style="width:283px;">To lyophilize materials.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Trypan Blue solution (0.4%)</td>
			<td style="width:211px;">Zhongkekeao, China</td>
			<td style="width:111px;">DA0065</td>
			<td style="width:283px;">To dye microgels.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td style="width:211px;">ENERGY CHEMICAL, China</td>
			<td style="width:111px;">A01E0801360010</td>
			<td style="width:283px;">To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Live/dead assay</td>
			<td style="width:211px;">Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan)</td>
			<td style="width:111px;">CS01-10</td>
			<td style="width:283px;">To distinguish alive and dead cells.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Cell Titer-Blue</td>
			<td style="width:211px;">Promega (Wisconsin, USA).</td>
			<td style="width:111px;">G8080</td>
			<td style="width:283px;">To test cell viability.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:211px;">BD Biosciences, USA</td>
			<td style="width:111px;">352360</td>
			<td style="width:283px;">To collect microgels.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">D-Luciferin</td>
			<td style="width:211px;">SYNCHEM (Germany)</td>
			<td style="width:111px;">s039</td>
			<td style="width:283px;">To tack cells.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Scanning electron microscope</td>
			<td style="width:211px;">FEI, USA</td>
			<td style="width:111px;">Quanta 200</td>
			<td style="width:283px;">To characterize microgel morphology.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">&#160;Mechanical testing machine</td>
			<td style="width:211px;">Bose, USA</td>
			<td style="width:111px;">3230</td>
			<td style="width:283px;">To measure mechanical features.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Programmable syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:211px;">World Precision Instruments, USA</td>
			<td style="width:111px;">ALADINI 1000</td>
			<td style="width:283px;">To test injactabiliy.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Digital force gauge</td>
			<td style="width:211px;">HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China</td>
			<td style="width:111px;">H-50&#160;</td>
			<td style="width:283px;">To test injactabiliy.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:199px;">Ethylene oxide sterilization system</td>
			<td style="width:211px;">Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC</td>
			<td style="width:111px;">AN74i</td>
			<td style="width:283px;">To sterilize microgels with ethylene oxide gas.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:211px;">Molecular Devices,USA</td>
			<td style="width:111px;">M5</td>
			<td style="width:283px;">To measure fluorescence intensity in micro-array.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:211px;">Nikon, Japan</td>
			<td style="width:111px;">A1Rsi</td>
			<td style="width:283px;">To observe cell distribution in 3D.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Xenogen&#160; Lumina II imaging system</td>
			<td style="width:211px;">Caliper Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:111px;">IVIS</td>
			<td style="width:283px;">To track cell in animals.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Liquid work stataion</td>
			<td style="width:211px;">Apricot design,USA</td>
			<td style="width:111px;">S-pipette</td>
			<td style="width:283px;">To load medium or cell suspension high-throuputly.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d microtissues for injectable regenerative therapy and high-throughput drug screening

为了将传统的2D 细胞培养技术升级到3D 细胞培养, 我们将微加工与 cryogelation 工艺相结合, 生产出大孔微尺度 cryogels (microcryogels), 可加载多种细胞类型, 形成 3D microtissues。在此, 我们提出了制造多功能 3D microtissues 及其在再生疗法和药物筛选中的应用的协议。尺寸和形状可控 microcryogels 可以在一个阵列芯片上制作, 可以被捕获片作为单独的细胞负载载体的可注射再生疗法或进一步组装在芯片上 3D microtissue 阵列的高通量药物筛选。由于这些微型 cryogels 的高弹性性质, 3D microtissues 在注射过程中保护细胞免受机械剪切力的侵袭, 为微创细胞治疗提供了巨大的可。这就保证了小鼠肢体缺血模型中细胞存活率的提高和治疗效果。同时, 以标准的 384-井格式组装 3D microtissue 阵列, 便于使用通用的实验室设施和设备, 使高通量的药物筛选在这个多才多艺的3D 细胞培养平台。

3D microtissue 形成的 microcryogels 的制备和表征。
根据该协议, microcryogels 是捏造的, 形成 3D microtissues 和个人 microcryogels 或 microcryogel 阵列, 并分别用于再生疗法和药物筛选 (图 1)。用 PMMA 制备的 Microstencil 阵列芯片作为 microcryogel 阵列芯片的 micromolds。microstencil 阵列芯片可进行可变几何设计。我们...

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3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

本协议描述了通过将微细加工与 cryogelation 技术相结合的方法制备弹性3D 大孔 microcryogels。在加载与细胞, 3D microtissues 生成, 这可以很容易地注入在体内, 以促进再生治疗或组装成阵列的体外高通量药物筛选。

3D Microtissues 用于可注射再生疗法和高通量药物筛选

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Research

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