Name: 3d microtissues for injectable regenerative therapy and high-throughput drug screening
Uploaded: 2017-10-04T11:45:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about 3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening at JoVE.com

Este trabajo fue apoyado financieramente por la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (subvenciones: 81522022, 51461165302). Los autores desean reconocer a todos los miembros de laboratorio de Du de asistencia general.

experimentos con animales seguido estricto protocolo aprobado por el Comité de ética Animal en el centro de análisis biomédico de la Universidad de Tsinghua. Bajo aprobación del Comité de ética, el tejido adiposo humano se obtuvo del Departamento de cirugía plástica de Pekín Unión Hospital con consentimiento informado de los pacientes.
 1. fabricación de 3D Microcryogels <ol><li>diseño y fabricación de chips de gama microstencil <ol><li>uso un software comerci...

Regenerativos modelos de medicina y en vitro para la detección de drogas son dos aplicaciones importantes de tejido ingeniería5,6,7,8,9. Mientras que estas dos aplicaciones tienen necesidades muy diferentes, una tierra común entre ellos radica en la necesidad de una más biomiméticos condición de cultivo para mejorar las funciones de la célula<s...

Cultura tradicional de la célula en aplanado superficies de dos dimensiones (2D), como una placa de cultivo o placas de varios pocillos, apenas puede provocar comportamientos celulares cerca de sus Estados nativos. Precisa recapitulación de microambientes celulares nativos, que forman parte de diversos tipos de células, matrices extracelulares y factores solubles bioactivos en arquitecturas (3D) tridimensional1,2,3 ,4, es esencial para construir biomimicking tejidos en vitro para aplicaciones en medicina regenerativa, ingeniería de tejidos, biología fundamental de investigación y drogas descubrimiento5,6,7 ,8,9.
En lugar de cultivo celular 2D, cultivo celular 3D es ampliamente utilizado para avanzar la micro arquitectura biomimética y características funcionales de las células cultivan en vitro. Es un método de cultura popular celular 3D agregadas células en esferoides7,8,9,10. Esferoides celulares podrían ser inyectados a los tejidos lesionados con mayor retención celular y la supervivencia en comparación con la inyección de células dispersas. Sin embargo, inevitable lesión mecánica impuesta en las células por la fuerza de esquileo flúida durante la inyección y tamaños no uniformes esferoide llevan al pobre celular efectos terapéuticos11,12,13. Del mismo modo, la inherente falta de uniformidad durante la agregación de esferoides ha hecho su traducción a 3D celular alto rendimiento de detección de drogas difíciles10.
Otro método para el cultivo celular 3D se logra con la ayuda de biomateriales, que por lo general encapsula las células en acuosos hidrogeles o andamios porosos. Permite una mayor flexibilidad en la construcción de arquitecturas 3D. Para la terapia, las células encapsuladas en andamios a granel se entregan generalmente al cuerpo animal a través de implantes quirúrgicos, invasivos y traumáticos, por lo tanto restringiendo su traducción amplia al paciente. Por otro lado, acuosos hidrogeles permiten terapia mínimamente invasiva mediante la inyección de células suspendidas en solución precursora de hidrogel en cuerpos de animales, lo que en situ la gelificación a través de termo-, reticulación química o enzimática11. Sin embargo, como las células se entregan mientras que los precursores de hidrogel son todavía en un estado acuoso, están también expuestos a esquileo mecánico durante la inyección. No sólo esto, reticulación química o enzimática durante la gelación en situ de hidrogel también podría imponer daño a las células dentro de. Para la detección de drogas, cultivos celulares asistida biomaterial problemas con uniformidad, capacidad de control y rendimiento. Utilizando hidrogeles, las células normalmente participan durante la gelificación, por el cual el proceso puede afectar la función y viabilidad de las células. Congelación durante la siembra de células también impide el uso por la mayoría de equipos de alto rendimiento, puesto que el hidrogel deba conservarse en hielo para evitar la congelación antes de la siembra de la célula, y el hidrogel puede atasc dispensadora de puntas, que son generalmente muy delgadas para asegurar la exactitud de proyección de alto rendimiento. Andamios de formados potencialmente podrían separar procedimientos de fabricación del biomaterial de cultivo celular, sin embargo la mayoría están disponibles como materiales a granel con relativamente bajo rendimiento14productos a base de andamio.
Para superar algunas de las deficiencias de los actuales métodos de cultura 3D, hemos desarrollado una tecnología de microfabricación-cryogelation integrado para fabricar un microcryogel estándar y fácil de usar array chip15. En este protocolo, gelatina es seleccionada para ejemplificar la técnica de fabricación de microcryogel ya que es biocompatible, degradable, rentable, y ninguna modificación adicional se requiere para la fijación de la célula. Otros polímeros de fuentes naturales o sintéticas también podrían utilizarse para la fabricación, dependiendo de la aplicación. Mediante esta tecnología, podemos fabricar microcryogels miniatura y muy elástico con controlable tamaño, forma y diseño. Cuando está cargado con una variedad de tipos de la célula, microtissues 3D podría formado para diversas aplicaciones. Estas características únicas permiten inyectabilidad deseado, protección celular y retención dirigida después de la inyección en vivo para mayor efectos terapéuticos. No sólo esto, la microcryogels podría ser procesado más lejos para formar matrices de microtissue 3D que son compatibles con el equipo común de laboratorio e instrumentos para realizar el cultivo celular de alto rendimiento para detección de drogas versátil y otros ensayos celulares. Aquí, vamos detallamos el proceso de fabricación de microcryogels y su posterior tratamiento como microtissues 3D individuales o conjuntos de microtissue 3D para dos aplicaciones importantes, terapia celular y detección de drogas, respectivamente10,15 .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:199px;">Gelatin</td>
			<td style="width:211px;">sigma</td>
			<td style="width:111px;">G7041</td>
			<td style="width:283px;">All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated.</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:199px;">Glutaraldehyde&#160;</td>
			<td style="width:211px;">J&#38;K</td>
			<td style="width:111px;">902042</td>
			<td style="width:283px;">Used as crosslinker in preparation of material.</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:199px;">Glass cover slip (24X50mm)</td>
			<td style="width:211px;">CITOGLASS, China</td>
			<td style="width:111px;">10212450C</td>
			<td style="width:283px;">To scrape prcursor solution onto microstencils array chips.</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:199px;">Sodium&#160;borohydride, NaBH4</td>
			<td style="width:211px;">Beijing Chemical Works</td>
			<td style="width:111px;">116-8</td>
			<td style="width:283px;">To wash remaining glutaraldehyde away after gelation.</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:199px;">Vacuum jar</td>
			<td style="width:211px;">asperts, China</td>
			<td style="width:111px;">VC8130</td>
			<td style="width:283px;">To preserve microgels under vacuum.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sunjin Electronics Co., Ltd, China</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:283px;">Ordinary PMMA sheets.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Rayjet laser system</td>
			<td style="width:211px;">Rayjet, Australia</td>
			<td style="width:111px;">Rayjet 50 C30</td>
			<td style="width:283px;">To engrave PMMA sheets to form wells.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Plasma Cleaner</td>
			<td style="width:211px;">Mycro Technologies, USA</td>
			<td style="width:111px;">PDC-32G</td>
			<td style="width:283px;">To make PMMA hyphophilic.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Lyophilizer</td>
			<td style="width:211px;">Boyikang, China</td>
			<td style="width:111px;">SC21CL</td>
			<td style="width:283px;">To lyophilize materials.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Trypan Blue solution (0.4%)</td>
			<td style="width:211px;">Zhongkekeao, China</td>
			<td style="width:111px;">DA0065</td>
			<td style="width:283px;">To dye microgels.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td style="width:211px;">ENERGY CHEMICAL, China</td>
			<td style="width:111px;">A01E0801360010</td>
			<td style="width:283px;">To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Live/dead assay</td>
			<td style="width:211px;">Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan)</td>
			<td style="width:111px;">CS01-10</td>
			<td style="width:283px;">To distinguish alive and dead cells.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Cell Titer-Blue</td>
			<td style="width:211px;">Promega (Wisconsin, USA).</td>
			<td style="width:111px;">G8080</td>
			<td style="width:283px;">To test cell viability.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:211px;">BD Biosciences, USA</td>
			<td style="width:111px;">352360</td>
			<td style="width:283px;">To collect microgels.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">D-Luciferin</td>
			<td style="width:211px;">SYNCHEM (Germany)</td>
			<td style="width:111px;">s039</td>
			<td style="width:283px;">To tack cells.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Scanning electron microscope</td>
			<td style="width:211px;">FEI, USA</td>
			<td style="width:111px;">Quanta 200</td>
			<td style="width:283px;">To characterize microgel morphology.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">&#160;Mechanical testing machine</td>
			<td style="width:211px;">Bose, USA</td>
			<td style="width:111px;">3230</td>
			<td style="width:283px;">To measure mechanical features.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Programmable syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:211px;">World Precision Instruments, USA</td>
			<td style="width:111px;">ALADINI 1000</td>
			<td style="width:283px;">To test injactabiliy.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Digital force gauge</td>
			<td style="width:211px;">HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China</td>
			<td style="width:111px;">H-50&#160;</td>
			<td style="width:283px;">To test injactabiliy.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:199px;">Ethylene oxide sterilization system</td>
			<td style="width:211px;">Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC</td>
			<td style="width:111px;">AN74i</td>
			<td style="width:283px;">To sterilize microgels with ethylene oxide gas.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:211px;">Molecular Devices,USA</td>
			<td style="width:111px;">M5</td>
			<td style="width:283px;">To measure fluorescence intensity in micro-array.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:211px;">Nikon, Japan</td>
			<td style="width:111px;">A1Rsi</td>
			<td style="width:283px;">To observe cell distribution in 3D.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Xenogen&#160; Lumina II imaging system</td>
			<td style="width:211px;">Caliper Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:111px;">IVIS</td>
			<td style="width:283px;">To track cell in animals.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Liquid work stataion</td>
			<td style="width:211px;">Apricot design,USA</td>
			<td style="width:111px;">S-pipette</td>
			<td style="width:283px;">To load medium or cell suspension high-throuputly.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d microtissues for injectable regenerative therapy and high-throughput drug screening

Para obtener cultivos celulares 2D tradicional cultivo celular 3D, hemos integrado microfabricación con tecnología cryogelation para producir macroporoso microescala cryogels (microcryogels), que puede ser cargado con una variedad de tipos de la célula para formar microtissues 3D. Adjunto, presentamos el protocolo para fabricar microtissues 3D versátil y sus aplicaciones en la terapia regenerativa y la investigación de la droga. Tamaño y microcryogels forma controlable puede ser fabricado en un chip de la matriz, que puede ser cosechada de chip como portadores cargados de células individuales para terapia regenerativa inyectable o ser más montado en un chip en arreglos de discos de microtissue 3D de alto rendimiento detección de drogas. Debido a la alta naturaleza elástico de estos cryogels de microescala, microtissues 3D exhiben gran inyectabilidad de terapia mínimamente invasiva celular protegiendo a las células de la fuerza de esquileo mecánico durante la inyección. Esto asegura la supervivencia realzada de la célula y el efecto terapéutico en el modelo murino de isquemia del miembro. Mientras tanto, conjunto de matrices de microtissue 3D en un formato estándar de 384-multi-well facilita el uso de instalaciones comunes de laboratorio y equipo, lo que permite la detección en esta plataforma de cultura celular 3D versátil de alto rendimiento drogas.

Fabricación y caracterización de microcryogels para la formación del microtissue 3D.
Según este protocolo, microcryogels fueron fabricados para forma el 3D microtissues y microcryogels individuales o conjuntos de microcryogel y fueron aplicados a la terapia regenerativa y de la droga detección, respectivamente (figura 1). Microstencil fichas de matriz de PMMA fueron aplicados c...

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3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Este protocolo describe la fabricación de microcryogels elástico macroporoso 3D integrando microfabricación con tecnología cryogelation. A cargar con las células, se generan microtissues 3D, que puede ser fácilmente inyectados en vivo para facilitar la terapia regenerativa o montado en arreglos de discos para en vitro screening de drogas de alto rendimiento.

Microtissues 3D para la terapia regenerativa inyectable y drogas de alto rendimiento

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

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Investigación

Bioingeniería

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